[发明专利]一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法。一种固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法，包括如下步骤：细胞悬液的制备、微生物细胞的固定化、固定化细胞转化L‑丙氨酸、固定化细胞的重复利用性和D‑丙氨酸的提取。本发明的固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法得到D‑丙氨酸回收率高，纯度高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法。

背景技术

丙氨酸(ALa)是构成人体蛋白质的20种基本氨基酸之一，是生命体的重要组成部分，根据其分子结构的手性和旋光性可分为L-丙氨酸和D-丙氨酸。D-丙氨酸是一种重要的有机手性源，在制药行业和食品生产行业都有广泛应用，例如生产新型抗生素、维生素B6及新型甜味剂阿力甜等。随着D-丙氨酸在食品、制药行业上的应用发展，市场上对D-丙氨酸的需求量也随之增长。目前，D-丙氨酸的生产制备方法主要有微生物发酵法、化学不对称合成法及氨基酰化酶拆分法，微生物发酵法生产周期长，发酵液成分复杂，产物含量低，分离纯化过程复杂，化学不对称合成法工艺复杂，所需要的手性助剂来源有限且价格昂贵，氨基酰化酶拆分法所需要的酶制剂成本高，制约了D-丙氨酸的大规模化生产。

固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一种核心技术。日本的千佃一郎在1960年开始研究固定化氨基酰化酶，并在1969年将其首次运用到工业化生产中，这在国际上是个突破。细胞固定化技术是指利用各种理化方法将游离细胞定位在有限的空间内并使其保持活力和可以反复利用的一种技术。固定化细胞有许多优点，能够长期保持细胞活力，可以反复利用，反应完成后，还易与产物分离，极大的提高了工业生产效率。

枯草芽孢杆菌内含有丙氨酸消旋酶，因此，能够将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，从而达到积累生产D-丙氨酸的目的。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明提供一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，该方法采用包埋法，将枯草芽孢杆菌包埋在聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体中，经优化后，用于转化L-丙氨酸生产D-丙氨酸。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)细胞悬液的制备：将枯草芽孢杆菌种子液按体积比1-1.5％的接种量接种到发酵培养基中，于发酵罐中发酵培养16-30h；发酵完毕后，离心得菌体，用去离子水清洗2次后，并用9g/L的氯化钠溶液重悬菌体；

(2)微生物细胞的固定化：称取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠，加热水溶解，得到聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为6-11％和0.5-3.0％，放入灭菌锅中121℃灭菌20min；待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配制的菌悬液，细胞浓度为0.1-5％，混匀后，用蠕动泵从15cm高处滴入含有0.5-3％氯化钙和1-3.5％硼酸的交联剂中，置于4℃冰箱中固化2-12h，固定化菌体直径为2.5-5.5mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗3-4次；

(3)固定化细胞转化L-丙氨酸：在发酵罐中依次加入固定化细胞，转化液和底物L-丙氨酸，进行转化反应；

(4)固定化细胞的重复利用性：固定化细胞在上述条件下进行反复转化，40-60h转化1批次，每批次结束后，用蒸馏水清洗小球，开始下1次反应；