[发明专利]一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法

权利要求书

1.一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）细胞悬液的制备：将枯草芽孢杆菌种子液按体积比1-1.5%的接种量接种到发酵培养基中，于发酵罐中发酵培养16-30h；发酵完毕后，离心得菌体，用去离子水清洗2次后，并用9g/L的氯化钠溶液重悬菌体；

（2）微生物细胞的固定化：称取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠，加热水溶解，得到聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为6-11%和0.5-3.0%，放入灭菌锅中121℃灭菌20min；待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配制的菌悬液，细胞浓度为0.1-5%，混匀后，用蠕动泵从15cm高处滴入含有0.5-3%氯化钙和1-3.5%硼酸的交联剂中，置于4℃冰箱中固化2-12h，固定化菌体直径为2.5-5.5mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗3-4次；

（3）固定化细胞转化L-丙氨酸：在发酵罐中依次加入固定化细胞，转化液和底物L-丙氨酸，进行转化反应；

（4）固定化细胞的重复利用性：将固定化细胞按步骤（3）的方法反复分批转化，40-60h转化1批次，每批次结束后，用蒸馏水清洗小球，开始下1次反应；

（5）D-丙氨酸的提取：用纱布过滤出固定化细胞，将反应混合液离心取上清，调pH至2.0-5.0，将其通入732强酸型阳离子交换树脂中；先用无菌水冲洗，再用1-3M氨水洗脱D-丙氨酸，收集洗脱液，用活性炭脱色，真空加热浓缩至D-丙氨酸结晶析出，用70%甲醇冲洗D-丙氨酸晶体，干燥，得D-丙氨酸成品。

2.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的发酵培养基的组成为：蔗糖3%、酵母膏0.5%、L-丙氨酸 0.4%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄·7H₂O 0.09%、CaCl₂ 0.02%，pH=6.5。

3.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（1）中发酵培养的条件为30℃，通气量1.0vvm，转速600rpm，pH6.5。

4.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中转化液的组成为：KH₂PO₄ 0.51%、K₂HPO₄ 0.22%、MgSO₄·7H₂O 0.2%和CaCl₂ 0.01%，pH=6.0。

5.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的固定化细胞的浓度为200-400g/L；所述的底物L-丙氨酸的浓度为100-200g/L。

6.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中反应的条件为：温度30℃，转速400r/min、通气量1.0vvm，pH =6。

7.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的转化反应的时间为40-60h。