[发明专利]PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法

说明书

本发明提供PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，选择PEDV流行毒株的基因组为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒。该串联重组质粒可以体外同时重组表达S1蛋白和M蛋白的主要抗原位点，该发明可为PEDV基因工程疫苗的研发提供重要的基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法。

背景技术

猪流行性腹泻是由流行性腹泻病毒（PEDV）感染所引起的肠道传染性疾病，以食欲下降、呕吐、腹泻和脱水为主要的临床症状。近年来，由于毒株发生变异，该病对哺乳仔猪造成了极大的危害，其感染率可达100%，这无论是给我国的养猪业还是养殖户都带来了很大的影响。目前对该疾病并无相当有效的药物进行治疗。

PEDV属于冠状病毒属，含有5个开放阅读框（ORF），编码4种主要的结构蛋白。S蛋白是病毒粒子表面的纤突蛋白，主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，并能诱导宿主产生中和抗体。但根据近年来的研究发现，S蛋白在受到宿主免疫选择的压力下易发生变异，导致宿主范围和毒力发生改变。有相关文献表明，2010年在我国已免疫的猪群中爆发的该病是由变异的PEDV毒株引发，且变异主要集中在S蛋白。因此，PEDV- S基因的变异可能是导致PED疫苗免疫效果不佳的原因。

PEDV另一主要结构蛋白M蛋白是冠状病毒外膜最主要的成分, 它的一级结构域对于装配是非常重要的。M蛋白为跨膜蛋白，较为保守，能间接诱导宿主а–干扰素的表达，并能够刺激机体产生相应的抗体，在补体存在条件下可中和病毒。因此，M蛋白可作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原。

基因工程疫苗的开发将是防控该病的一个重要的方向。因此，本发明选择PEDV最新流行毒株的基因组为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒。该串联重组质粒可以体外同时重组表达S1蛋白和M蛋白的主要抗原位点，该发明可为PEDV基因工程疫苗的研发提供重要的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

参照NCBI中已发表的PEDV M基因序列( KX253991.1 )和S基因序列（KU363118.1 ），采用Primer 7.0 软件设计特异性引物如下（带有下划线的为酶切位点），由上海生物工程有限公司合成。

M-F：CGGGATCC ATGTCTAACGGTTCTATTCC （BamH I）

M-R：GCGTCGAC TTAGACTAAATGAAGCACT（Sal I）

该引物扩增片段大小697bp；

S-F：5´-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3´（HindIII）

S-R：5´-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3´（NotId）

该引物扩增片段大小为639bp。

PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，具体包括如下步骤：

（1）提取病毒RNA；