[发明专利]PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法

权利要求书

1.PEDV M基因和S1基因串联重组质粒的构建方法，其特征在于：选择PEDV流行毒株的M基因序列 KX253991.1和S基因序列KU363118.1为模版，分别针对S1基因和M基因的主要抗原位点，设计特异性引物，以PET32a为表达载体，设计特异的酶切位点，构建S1基因和M基因的串联重组质粒；

所述引物如下：

M-F：CGGGATCCATGTCTAACGGTTCTATTCC ；

M-R：GCGTCGAC TTAGACTAAATGAAGCACT ；

该引物扩增片段大小697bp；

S1-F：5´-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3´；

S1-R：5´-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3´；

该引物扩增片段大小为639bp；

具体包括如下步骤：

（1）提取病毒RNA；

（2）M基因和S1基因的PCR扩增：病毒RNA反转录为cDNA，经PCR扩增目的基因；PCR扩增的目的基因产物进行琼脂糖凝胶电泳后，将含目的基因片段的胶切割，胶回收试剂盒纯化目的基因；

（3）重组M蛋白表达质粒的构建与鉴定：将M基因PCR产物和pET-32a质粒分别经BamH I和Sal I双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，M蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-M；所述PCR鉴定引物为M-F/M-R与T7-F/T7-R；

（4）分别用HindIII和NotId酶对S1基因的胶回收产物和M蛋白重组表达质粒pET-32a-M进行双酶切反应；将双酶切胶回收产物的目的基因片段和M蛋白重组表达质粒，过夜连接；将过夜连接后的串联重组质粒，转化到DH5α感受态细胞，37℃ 200r/m震荡孵育过夜；利用2对引物进行PCR鉴定,利用BamH I和Sal ，IHindIII和NotId酶进行酶切鉴定；所述2对引物为S1-F/S1-R与T7-F/T7-R；所述T7-F/T7-R引物如下：T7-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7-R：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。