[发明专利]无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法

说明书

本发明涉及一种无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法，该无外源支架血管化组织工程骨是由上层成血管内皮细胞膜片和下层成骨细胞膜片构成。本发明利用兔脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能的特性，将其诱导分化，制备了具有成骨能力及成血管能力的双细胞膜片，并用它们构建血管化组织工程骨。其细胞来源丰富，易于分离获取，对供体创伤小，培养要求低；构建血管化组织工程骨所需成骨细胞、内皮细胞均来自于脂肪间充质干细胞，无需额外添加不同来源的内皮细胞；利用细胞自分泌细胞外基质作为“内源性支架”，避免了机体免疫排异及炎症反应；制备方法简单，条件温和，具有良好的成骨和成血管性能。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种由成骨细胞膜片和成血管内皮细胞膜片构建的无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法。

背景技术

严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的大块骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战,一直是人类几个世纪以来不断深入研究和探索的重要课题。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。自体骨移植是公认的骨组织修复的金标准，但是患者要经受自体组织移植手术的创伤，而且供区有限，因此，自体骨移植不能视为理想的大面积骨缺损的修复方法；异体骨移植存在免疫排斥反应、疾病传播等风险，有时甚至危及病人生命；人工骨植入容易导致异物排斥反应、感染等。因此,有必要寻找一种新的大块骨缺损的修复手段。

在此情况下，组织工程学的兴起和发展,为骨缺损的修复提供了新的可能，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望。

近年来,骨组织工程的研究取得了很大进展,应用组织工程技术在小型哺乳动物体内构建骨组织,修复小尺寸的骨缺损的方法已基本成熟，但是对于大型哺乳动物大范围或受区血供不佳的骨缺损，由于移植物早期没有独立的血液供应，营养渗透不足，骨痂形成缓慢等原因，成骨效果仍不稳定。有研究表明,决定和制约组织工程骨修复骨缺损疗效的关键是其在体内血管化的速度和程度。sahota等也认为组织工程植入物失败的主要原因在于血管化的迟滞。因此，如何建立有效的血液供应,在体内构建能及时血管化的组织工程骨,缩短骨愈合时间是目前骨组织工程研究的一个重要方向，也是制约组织工程骨大规模临床应用的关键。

目前组织工程骨的血管化策略主要包括：支架的设计开发、应用生长因子、体内埋植、体内动脉小室和整体培养系统等。尽管这些方法在一定程度解决了组织构建时的血管化问题，但均存在不足。比如，在支架的制作过程中，对材料内部的孔隙大小和相互连接进行修饰,可有利于血管网的长入，但存在炎症反应、潜在的免疫原性风险等,而且血管化速度不理想；促血管生长因子应用时存在调控问题，生长因子在体内半衰期较短,大剂量应用又有致畸可能，并且可能加速某些病理过程，如血管瘤的发生等；体内埋植和体内动脉小室均需二次手术，供体选择困难，有潜在的疾病传播风险等，限制了临床应用；整体培养系统为完善的“人造器官”，但技术难度高，实现困难。

近年，国内外研究人员通过血管内皮细胞与成骨细胞联合培养的技术方法，构建出血管化组织工程骨，即可形成骨组织又可同时血管化。但传统的“细胞－支架”策略的不足之处在于：种子细胞在种植到支架材料的过程中，有30-40％的细胞不能粘附于支架而流失，细胞附着率低、利用率差；细胞之间相互作用少，难以形成体内细胞应有的微环境，细胞支架复合物植入体内后，骨形成总是发生在支架的外周，影响成骨的大小和质量。为了解决上述问题，人们研究出细胞膜片技术。它是通过体外对细胞进行高密度培养,使细胞生长成为多层并分泌大量细胞外基质,形成由细胞和细胞外基质构成的细胞膜片。细胞膜片技术应用于组织工程中主要有三方面优势:一、膜片的形成能够减少组织构建过程中细胞的流失和损伤,提高细胞利用率；二、细胞膜片具有一定的机械强度,能够在无支架的情况下进行组织构建,避免了支架材料引起的组织相容性问题,且易于操作、价格低廉；三、丰富的细胞外基质为细胞提供适合的生长环境,并在发育过程中储存和激活生长因子,为组织的发育提供结构和功能帮助。所以，如能将成骨细胞膜片联合内皮细胞膜片，通过合适的方法构建血管化组织工程骨，预计将较成骨细胞与内皮细胞共培养更具血管化和成骨优势。