[发明专利]无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法

权利要求书

1.一种无外源支架血管组织工程骨，其特征在于其是由上层成血管内皮细胞膜片和下层成骨细胞膜片构成，其中用于制备所述成血管内皮细胞膜片的内皮细胞和用于制备所述成骨细胞膜片的成骨细胞均来源于脂肪间充质干细胞，其制备工艺包括：

1）成骨细胞膜片的制备

将第三代或第四代脂肪间充质干细胞先用胰蛋白酶消化，然后用DMEM/F12培养基终止消化，按1×10⁶～3×10⁶ 个/cm²的密度接种至培养皿中，加入含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基上，置于37℃，5％ CO₂恒温培养箱中培养24～48h，然后再用成骨细胞诱导培养液培养10～14天即可；

2）成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶ 个/cm²的密度接种于含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基中培养24～48h，然后再用血管内皮细胞诱导液持续培养10～14天即可；

3）无外源支架血管化组织工程骨的构建

将上述过程2）所得的成血管内皮细胞膜片折叠，平铺在上述过程1）所得的已经折叠好的成骨细胞膜片上，静置5min，期间间断滴加含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基，最后折叠卷曲成类圆柱体。

2.按照权利要求1所述的无外源支架血管组织工程骨，其特征在于过程1）中，所述成骨细胞诱导培养液组成为：DMEM/F12培养基170～180ml，胎牛血清 17～22ml，双抗1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠 2～3ml，地塞米松15～25ul。

3.按照权利要求1所述的无外源支架血管组织工程骨，其特征在于过程1）中，用成骨细胞诱导培养液培养时，隔日换液培养。

4.按照权利要求1所述的无外源支架血管组织工程骨，其特征在于过程2）中，所述血管内皮细胞诱导液组成为：内皮细胞生长培养基90～110ml，胎牛血清 4.5～5.5ml, 维生素C0.09～0.11ml, 庆大霉素-两性霉素B 0.09～0.11ml, 氢化可的松0.036～0.044ml, 人表皮生长因子0.09～0.11ml, 人成纤维细胞生长因子0.45～0.55ml, 类胰岛素一号增长因子0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子0.09～0.11ml。

5.按照权利要求1所述的无外源支架血管组织工程骨，其特征在于过程2）中，用血管内皮细胞诱导液培养过程中，隔2-3天换液培养。