[发明专利]病毒介导的基因沉默的VIGS载体

权利要求书

1.一种病毒介导的基因沉默载体，包括可转移的核苷酸序列和允许所述可转移的核苷酸序列转入植物基因组中的边界序列；

所述可转移的核苷酸序列包括启动子、重组FoMV的cDNA序列和终止子；

所述重组FoMV的cDNA序列包含FoMV RNA依赖的RNA聚合酶的基因编码序列、FoMV三基因盒的基因编码序列、FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列和两个FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子；

将所述两个FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子分别命名为第一个CP亚基因组启动子和第二个CP亚基因组启动子；所述第一个CP亚基因组启动子用于启动外源核苷酸序列的转录；所述第二个CP亚基因组启动子用于启动FoMV外壳蛋白CP基因编码序列的转录；

所述第一个CP亚基因组启动子位于所述FoMV三基因盒的基因编码序列的3’端；

所述第二个CP亚基因组启动子位于所述FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列的5’端；

所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子包含相同的序列；

所述第一个亚基因组启动子为序列1第5202-5371位所示的核苷酸序列；

所述外源核苷酸序列位于所述第二个CP亚基因组启动子的5’端；

所述边界序列为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-DNA的左边界和右边界序列。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或含有双增强子的CaMV 35S启动子；

或，所述终止子为Nos终止子；

所述载体还包括poly-A序列，其位于所述Nos终止子的5’端；

或，所述外源核苷酸序列通过多克隆位点插入所述载体；

或，所述多克隆位点位于所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子之间。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：

所述载体为FoMV-sg，其为将序列10所示的DNA分子插入pYL44载体的StuI和XbaI酶切位点间，且保持pYL44载体的其他序列不变得到的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：

所述外源核苷酸序列是对应于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列；

或，所述外源核苷酸序列是与靶基因反向互补的序列；

或，所述外源核苷酸序列的大小为100-300bp；

或，所述外源核苷酸序列是靶基因的反向重复序列，所述反向重复序列转录后形成发卡结构；

或，所述反向重复序列由靶基因的正向序列和靶基因的反向互补序列组成；所述靶基因的正向序列和所述靶基因的反向互补序列的大小均为40-70bp；

或，所述靶基因为与植物生长、发育、植物抗病或植物非生物胁迫途径相关的基因。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述载体包含所述FoMV-sg和插入到多克隆位点中的对应于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列。

6.权利要求4或5所述的载体的构建方法，其包括将所述外源核苷酸序列即靶序列克隆到所述载体的多克隆位点中的步骤。

7.一种用VIGS技术沉默植物组织中靶基因的方法，其包括将权利要求4或5所述的载体转入植物组织中的步骤；

所述方法导致植物组织中对应的靶基因的mRNA 50％以上被沉默；

所述植物组织为处于2-3叶期的植物组织；

所述载体通过农杆菌介导T-DNA转入所述植物组织中；

所述植物为单子叶植物。

8.一种分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求7所述的方法在植物、植物的一部分或在植物生长发育某一阶段沉默靶基因；

2)观察所述靶基因被沉默后的植物表型。

9.来源于权利要求1-5中任一所述的载体的RNA转录物。