[发明专利]一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物检测，具体涉及一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法。

背景技术

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌即尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的一种维管束系统病害，是一种毁灭性的土传病害，在世界各地均有不同程度发生。近年来，由于种植制度的改变(如高产连作)，该病害发生严重，已成为制约我国西瓜产业发展的主要障碍。因此，准确、快速地检测西瓜枯萎病菌，对于一个地区西瓜枯萎病综合防治具有重要意义。

目前对西瓜枯萎病菌的定量检测方法通常采用选择性培养基进行病菌的分离培养和菌落计数。这种方法准确性低、费时，且易受杂菌影响。随着分子生物学技术日益成熟，荧光定量PCR技术已广泛用于植物病原菌动态检测和预警。

国内外已有研究报道关于西瓜枯萎病菌的分子检测方法。如中国农业科学院的曹月霞等、中兴大学的Lin Yinghong等，以及南京农业大学的Zhang Zhenggang 等建立了可以特异性鉴定西瓜枯萎病菌的普通PCR分子检测体系。Zhang Zhenggang等还建立了可以定量检测西瓜枯萎病菌的荧光定量PCR方法，然而该方法是以西瓜枯萎病菌DNA浓度量化待测样品，所得结果单位为ng DNA每克土，而非菌数每克土，不能直观的了解土壤中西瓜枯萎病菌的浓度。此外，国内尚无西瓜枯萎病菌定量检测方法的专利。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法，该方法可对土壤中西瓜枯萎病菌数量进行快速检测定量。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)制备含不同浓度西瓜枯萎病菌的系列梯度标准土样；

(2)利用土壤DNA提取试剂盒分别提取系列梯度标准土样和待测土样总 DNA；

(3)选定并合成可用于西瓜枯萎病菌检测的特异性引物，分别以步骤(2) 提取的系列梯度标准土样总DNA以及待测土样总DNA为模板，进行荧光定量 PCR反应，分别得到系列梯度标准土样和待测土样的Ct值；

(4)根据系列梯度标准土样中西瓜枯萎病菌浓度和相应的Ct值制作标准曲线，根据待测土样荧光定量PCR反应Ct值和标准曲线，，通过计算即可获得待测土样中西瓜枯萎病菌浓度。

其中，步骤(1)所述含不同浓度西瓜枯萎病菌的系列梯度标准土样的制备方法为：取耕地土壤风干后灭菌获得土样；将西瓜枯萎病菌菌丝块接种到装有绿豆液体培养基的三角瓶中，培养得到西瓜枯萎病菌孢子液，计数后将孢子液依次稀释，取稀释后的孢子液加入到土样中风干，即获得含不同浓度西瓜枯萎病菌的系列梯度标准土样。

所述系列梯度标准土样中西瓜枯萎病菌浓度依次为2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、 2×10⁵、2×10⁴、2×10³和2×10²个/g土。

其中，步骤(3)所述特异性引物对为Fon-1/Fon-2。通过Fon-1/Fon-2引物对可从西瓜枯萎病菌中特异性扩增出174bp的产物。

进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 10μL、上下游引物各0.4μL(浓度均为10μmol/L)、ROX Reference Dye II 0.4μL、DNA 模板2μL、灭菌超纯水补足至20μL。荧光定量PCR反应程序为95℃30s；95℃ 5s，60℃34s，40个循环。

本发明所述的土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法，是采用荧光定量PCR 技术，以西瓜枯萎病菌浓度已知的标准土样绘制标曲，从而定量检测待测土样中的西瓜枯萎病菌浓度的检测技术。可用于西瓜枯萎病菌的跟踪检测。

有益效果：与现有技术相比，本发明优点如下：