[发明专利]具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种具有抑制二肽基肽酶‑4的活性肽及其制备方法和应用，该抑制肽的氨基酸序列为：Ala‑Gly‑Phe‑Ala‑Gly‑Asp‑Asp‑Ala‑Pro‑Arg‑Ala。本发明采用现代生化技术手段，对杂色蛤中的抑制二肽基肽酶的活性成分进行跟踪筛选和评价，通过酶解、乙醇沉淀、离子交换树脂和反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到，实验结果表明，该抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶‑4的作用，具有很好的降血糖的功效，并且安全性能好，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种活性多肽，具体涉及一种从杂色蛤软体酶解物中分离得到的具有抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)活性的多肽，属于生物医药技术领域。

背景技术

二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)是一种丝氨酸蛋白酶，能迅速裂解和失活肠促胰岛素、神经肽和细胞因子。DPP-4可特异性切断GLP-1肽链N端2位上的丙氨酸或脯氨酸残基，从而使GLP-1失活。GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是一种重要的肠促胰岛素，除能促进胰岛素分泌及抑制胰高血糖素分泌外，还具有增加饱腻感、减缓胃排空时间、抑制胰岛β细胞凋亡和促进β细胞增殖等作用。由于可被DPP-4迅速降解，GLP-1的体内半衰期极短(小于2min)，若能抑制DPP-4活性则可有效延长GLP-1的作用时间，从而有利于降低血糖水平，具有治疗高血糖的作用。

现代研究表明，活性肽与蛋白质及单一氨基酸相比，具有更强的生物活性和营养价值。活性肽专属性强、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多种功能，作为预防和治疗疾病的医药产品进行研究有着巨大的开发潜力。而食源性的DPP-4抑制剂控制高血糖起效快、作用强、安全性高，目前己经在临床治疗糖尿病中发挥了重要的作用。

杂色蛤(Ruditapesphilippinarum)是广泛分布于江苏沿海的一种重要双壳经济贝类。传统中医理论认为其贝壳和软体部份均可入药，蛤蜊肉咸、冷、无毒，归胃、肝、膀胱经，宋代《嘉祐本草》中关于蛤蜊有记载：“润五脏，止消渴，开胃，解酒毒。主老癖能为寒热者，及妇人血块，宜煮食之”。

发明内容

发明目的：本发明的目的是在杂色蛤现有研究的基础之上，通过大量实验筛选，采用现代生化技术手段，对杂色蛤中的抑制DPP-4的活性成分进行跟踪评价，通过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种DPP-4抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制DPP-4的作用，具有很好的降糖的功效。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽，该抑制肽具有下述的氨基酸序列：Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala。

本发明所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，其包括以下步骤：

(1)杂色蛤酶解物的制备：

将杂色蛤软体洗净泥沙，加水煎煮，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加水匀浆后，加入生物酶酶解，酶解结束后,于沸水浴灭活，然后加入无水乙醇进行醇沉，静置，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；

(2)离子交换色谱纯化：

取步骤(1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，经过离子交换色谱分离，流动相：A相为水，B相为0.8mol/L的氯化钠溶液，梯度洗脱，流速：2mL/min；检测波长：220nm；经过离子交换色谱分离得到不同组分的酶解物，分别测定各组分对二肽基肽酶-4的抑制活性，取活性最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉；

(3)反向色谱分离纯化：