[发明专利]人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法

说明书

本发明公开了人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法。本发明选择利用基因编辑技术对玉米育性基因Ms26进行定点修饰，删除5号外显子，从而改变Ms26基因表达的蛋白功能，创制出雄性不育植株，为玉米杂种优势的利用提供了基础。本发明还采用含有基因编辑转化体的植株作为突变的供体与受体材料进行杂交，通过活体内定向突变可直接突变受体材料中的野生型基因，在BC2代进行自交获得受体背景的玉米雄性不育材料。不仅避免了回交导入的连锁累赘，而且还大大提高了回交转育效率，缩短了育种周期。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及人工创制玉米雄性不育系与高效的转育方法。

背景技术

杂种优势在遗传学上是指杂交子代在生长、成活、繁殖能力或生产性能等方面均优于双亲均值的现象。玉米是杂种优势利用最为成功的作物之一。因此，杂交种制种是种业开发的重要环节。人们可通过人工或机械去雄来保持杂交种的纯度，但这种方法存在着工作量大、成本高、去雄不彻底而影响种子纯度与质量等缺点。雄性不育系的应用可以大大降低种子生产成本、提高种子质量、保护母本等优势，在玉米杂种优势利用过程中具备重要应用价值。以细胞质不育为基础的三系配套法(不育系、保持系、恢复系)的出现大大的提高了杂交种创制的效率，但依然存在着不育系不稳定、恢复系匹配不成功、细胞质专化性小斑病等生产风险。目前，以单隐性基因控制的核不育为基础的两系配套法(不育系、恢复系)可以有效解决了细胞质不育系的问题，提高效率，降低生产风险。

当前已经鉴定出几十种玉米相关的育性基因。以玉米育性核基因Ms26为例，该基因位于1号染色体的短臂上，由5个外显子组成，它的氨基酸序列和细胞色素P450家族中的一个成员CYP704B1-Zm基因高度的同源。细胞色素P450蛋白多数属于长链脂肪酸ω-羟化酶，参与长链脂肪酸的ω-羟化过程，这种酶是花粉粒形成孢外壁的关键酶，缺少这种酶就会造成花粉孢外壁长链脂肪酸合成受阻，从而出现花粉粒孢外壁异常导致植株败育。Heme结合结构域是细胞色素P450蛋白中关键的保守结构域，位于Ms26基因的5号外显子上，其氨基酸序列如图1所示。通过对该基因定向突变，可以创制隐性核基因不育系。

2012年，一种基于细菌利用RNA向导的免疫系统—规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是继归巢核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(zinc-fnger nucleases，ZFNs)、类转录激活效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)之后，具有高灵敏度、靶向范围广、设计操作简便等优点的基因编辑技术。CRISPR/Cas9技术原理是通过向导RNA的定点靶向作用，融合Cas9蛋白结合DNA靶点产生双键断裂(double-strand breaks，DSB)，并引入两种修复方式—非同源末端连接修复方式(non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复(homology-directed repair，HDR)，从而实现DNA的定向编辑,创制目标基因定点突变。

传统的回交育种过程中，通常通过目标基因回交导入到受体，再通过受体高代回交实现轮回亲本遗传背景回复。在目标基因的回交导入过程中，尤其是在目标基因的两侧往往带入了供体亲本的染色体片段，称之为连锁累赘。要打破这种连锁累赘需要通过在大群体中逐个单株鉴定减数分裂过程中，于目标基因两侧发生双交换而导入目标基因但遗传背景回复高的个体，工作量巨大，成本高，效率低。连锁累赘成为回交育种中重要的限制因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何培育玉米雄性不育系及其高效转育的方法。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种培育玉米雄性不育系的方法。

本发明提供的培育玉米雄性不育系的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体玉米基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到玉米雄性不育系。