[发明专利]特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用

说明书

本发明公开一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用。该引物对是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列设计的特异性PCR引物对，其序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。本发明能够特异性检测柑橘螺原体(Spiroplasma citri)，无需进行螺原体的分离培养，可以直接从柑橘总DNA中检测病原。本发明检测灵敏度高，可检测低至10^‑5ng/μL的柑橘总DNA中的螺原体。本发明检测耗时较短，经济适用，总体流程在3～4小时，单个样品的检测费用成本仅5～6元。

技术领域

本发明涉及一种外来入侵植物病害的检测技术，特别涉及一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用。

背景技术

螺原体是一种直径约为100～250nm，基本形态为螺旋形的无细胞壁的原核微生物。1973年建立了螺原体属(Spiroplasma)，目前发现的螺原体，根据血清学特性将其分为34个血清组，并已确立了37个螺原体种。螺原体和宿主的关系可分为共生(Mutualism)、互生(Commensalism)和致病(Pathogenic)3种，其中致病螺原体可导致蜜蜂的“五月病”和“爬蜂病”，虾蟹颤抖病，柑橘僵化病(Citrus stubborn)、玉米矮缩病等，对蜜蜂业、水产养殖业和农业生产造成严重影响。

植物螺原体主要存在于植物筛管部和吸食植物汁液的昆虫体内，这些昆虫只是螺原体传播的媒介，绝大多数植物病原性的螺原体对介体昆虫并不致病。柑橘僵化病是由韧皮部限制的螺原体(Spiroplasma citri)引起的，田间通过柑橘叶蝉传播的。病原感染大多数柑橘品种和栽培品种，主要分布在热带和干旱的柑橘种植区，包括美国加利福尼亚、亚利桑那州，北非，东地中海盆地和中东。受侵染的柑橘导致严重发育不良，叶片致密且异常直立，叶片褪绿，类似营养缺乏症状，后期造成严重的产量损失。

螺原体由于没有细胞壁、个体微小，相比于其它微生物，螺原体的分离、显微镜检查等方法都比较困难，国内除王文等对虾蟹中的螺原体研究较深入外，其它种类螺原体仅限于分离鉴定和生物学特性的研究。2004年王文等基于细菌16S rDNA，利用PCR技术检测河蟹颤抖病的病原，研究发现病原是一个螺原体新种，命名为中华绒螯蟹螺原体；2012年李霞等利用细菌的16S rDNA通用引物扩增并测序比对，检测到蜜蜂中的一株新的致病螺原体。目前螺原体的检测主要是基于细菌的16S rDNA序列，首先需要进行螺原体的培养，再提取螺原体的DNA，然后利用细菌通用引物进行PCR扩增，最后需要进一步的测序比对验证试验结果。为进一步提高特定螺原体的检测效率和灵敏度，还需要探索寻找其它基因或核酸片段应用于特定螺原体的特异检测，无需进行繁琐的螺原体培养过程，直接从宿主总DNA中特异检测螺原体病原。

柑橘螺原体已经列入中国外来入侵物种数据库，柑橘僵化病在国内尚未见田间报道，随着全球经济一体化进程加快，需要加强对外来柑橘病害的检疫检测，一套良好的柑橘螺原体检测方案对病原体的检测以及病害的预防和控制都非常重要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对。

本发明的另一目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对或试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对，该引物对是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列设计的特异性PCR引物对，其序列如下：

上游引物Scf：5'-CACCTGCAACTGTAGCAACA-3'；(SEQ ID No：1)