[发明专利]表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。主要包括构建基于冰核蛋白的表面展示谷氨酸脱羧酶的重组工程菌，将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种到培养基中振荡培养，加入IPTG或乳糖诱导谷氨酸脱羧酶的表达，收集的表面展示谷氨酸脱羧酶的重组菌，并用于底物谷氨酸脱羧制备γ‑氨基丁酸。本发明避免了常规表达胞内酶的全菌体转化中需要进行透性化处理的过程，因重组酶展示表达在重组菌表面，底物不需进入菌体细胞就可与重组酶接触完成转化，达到提高重组菌体表观活力的目的。本发明的方法简便、成本低、易于操作，可高效提高菌体的谷氨酸脱羧酶的表观活力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸。它具有降血压、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等功能，也可作为合成生物可降解材料聚酰胺-4(PA4)和环境友好的塑料溶剂N-吡咯烷酮的前体物质。因此GABA在医药、食品保健、化工、农业等方面具有广泛的应用。

目前国内外GABA主要制备方法有化学合成法、微生物发酵法和生物转化酶法三种。谷氨酸脱羧酶(GAD)能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳，广泛存在于乳酸菌、大肠杆菌及曲霉菌等微生物中。基于GAD的生物转化酶法具有反应条件温和、产品纯度高、后处理工序简单、生产周期短、环境污染少等优点，是未来GABA制备工艺开发的主要方向。

微生物GAD是胞内酶，制备GAD酶制剂需经细胞破碎、提取与纯化等复杂步骤，加上酶纯化过程中活力的损失均会导致生产成本增加。利用微生物细胞制备GABA，可以省去冗繁的酶制备工艺与时间，大大节省成本，但由于菌体细胞壁与细胞膜的屏蔽作用，限制了底物与产物在细胞内外的交换，使菌体胞内的GAD难以充分发挥，严重影响了微生物的表观催化活力，使底物转化速率降低。有效改善菌体细胞壁与细胞膜对底物的传质阻力来提高GAD的表观催化活力对于高效制备GABA意义重大。

为提高含谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌的表观催化活力，人们采取了多种方法。如专利CN201110020575.6中将短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因GADB、转运蛋白基因gadC和调控蛋白基因gadR共表达，实现谷氨酸进入细胞的速率与转化速率的提高。专利CN103789246B中报道了对诱导表达的重组菌加热处理提高菌体通透性的方法。专利CN103773731A中报道了诱导重组酶表达同时加入细胞壁合成抑制剂或表面活性剂干扰重组菌细胞壁和(或)细胞膜合成，增加菌体通透性、提高菌体表观催化活力的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服重组表达菌胞内酶需要细胞破碎后再分离纯化，步骤繁琐的弊端；以及利用含胞内酶的重组菌全细胞催化时受细胞壁和(或)细胞膜对底物与产物的传质阻力影响，表观催化活力不足的问题。本发明提供表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。本发明技术方案低成本，简便，易于操作，可高效提高菌体的谷氨酸脱羧酶的表观活力。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将展示基元编码基因和谷氨酸脱羧酶编码基因融合串联，连接到表达载体上，构建、筛选重组表达载体，再将重组表达载体导入宿主细胞获得表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌。

所述的展示基元选自冰核蛋白(INP)、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)、芽孢杆菌外层衣壳蛋白(CotB、CotC、OxdD等)、酵母表面蛋白(a-凝集素、ɑ-凝集素、Flolp等)或乳杆菌S层蛋白SlpA等，及其锚定功能结构域(展示基元蛋白中能起到靶定宿主细胞作用的部分蛋白功能区)。优选为冰核蛋白INP。

所述的谷氨酸脱羧酶编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。