[发明专利]基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法。

背景技术

桔小实蝇Bactrocera dorsalis，又名东方果实蝇(Orient fruit fly)，属双翅目(Diptera)，实蝇科(Tephritidae)，果实蝇属Bactrocera Macquart，是一类重要的检疫性害虫。该虫寄主范围广，据报道可以为害46科250多种水果，对香蕉、番石榴、芒果和柑橘等为害严重，给我国水果产业造成巨大的经济损失。目前生产上主要采取化学防治控制其危害，但化学农药不仅易造成水果和环境污染，且因其为害方式特殊(主要以成虫产卵于果实果皮下，幼虫潜居果瓤取食，有果皮的物理屏蔽)而难以奏效。由于植食性昆虫对其嗜好的寄主植物气味有明显的选择倾向，而桔小实蝇对于多种寄主水果也具有较明显的嗜好性，如番石榴、葡萄、甜橙、香蕉等水果均是桔小实蝇的重要水果寄主，而桔小实蝇也都能够对它们产生显著的嗅觉引诱反应，因此我们可以根据桔小实蝇的主要寄主水果挥发物筛选和获得其嗅觉引诱剂。但由于各种水果的挥发物成分种类复杂，如何筛选出合适的引诱剂配方成为制约桔小实蝇嗅觉引诱剂尤其是雌虫引诱剂的瓶颈。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法的技术方案。

所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)收集桔小实蝇触角总RNA；

2)通过RT-PCR获得桔小实蝇气味结合蛋白的全长；

3)构建桔小实蝇气味结合蛋白的原核表达载体；

4)通过IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

5)通过竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱，解离常数KD低于10μmol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30μmol/L时，确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。

所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，所述的步骤4) 中IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为 0.8～1.2mmol/L，温度为28～32℃，诱导转速为150～250rpm，诱导时间为 4～6h。

所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，所述的步骤4) 中IPTG诱导桔小实蝇重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为 1.0mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。

所述的基于桔小实蝇气味结合蛋白的引诱剂筛选方法，所述的步骤5) 中竞争性荧光结合方法获得桔小实蝇重组气味结合蛋白与寄主水果气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括：

1)荧光配基1-NPN与桔小实蝇重组气味结合蛋白的结合在282nm激发波长下，向1μmol/L的桔小实蝇重组气味结合蛋白中逐次加入 1mmol/L的1-NPN，充分混匀；

2)配基结合和EAG验证

选取桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物和1-NPN进行竞争结合桔小实蝇重组气味结合蛋白，如果桔小实蝇寄主水果主要气味挥发物、1-NPN与 BdorOBP相对荧光值竞争至50％以下，并且解离常数KD低于10μmol/L寄主水果嗅觉以下，荧光竞争的IC50值小于30μmol/L时或者荧光值竞争至 30％以下时，则确定为适合桔小实蝇的寄主水果嗅觉引诱剂。

本发明从桔小实蝇嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其气味结合蛋白全长基因，并通过原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学结合技术探讨了其与不同茶树来源的寄主水果嗅觉挥发物的亲和力。本发明为桔小实蝇寄主水果嗅觉气味信息引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：收集桔小实蝇触角总RNA以及气味结合蛋白OBP的基因克隆

1桔小实蝇气味结合蛋白BdorOBP2的克隆

1.1桔小实蝇总RNA的提取

采用Trizol试剂提取桔小实蝇的总RNA，具体操作步骤如下：

1)从-80℃取出保存的桔小实蝇样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100mg组织样品装入1.5mL离心管中，然后加入1ml Trizol试剂，漩涡混合器上进行混合；