[发明专利]一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

一、包被瓶制备：

(1)、将人Ⅳ型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；

(2)、取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置4℃冰箱中过夜；

(3)、弃上清，置于超净工作台中干燥；

(4)、包被瓶置4℃冰箱中保存备用；

二、皮肤干细胞制备：

(5)、取脸颊或下巴皮肤组织，去除脂肪组织；

(6)、将皮肤切成0.5mm×0.5mm的小块，用PBS冲洗三次；

(7)、组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶Ⅱ的消化液，4℃，过夜消化；

(8)、用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm³的小块；

(9)、用含体积分数为0.5％Ⅰ型胶原酶的消化液，于37℃，对真皮层小块轻摇消化1h；

(10)、再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；

(11)将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×10⁵/ml；

(12)、将上述细胞悬液接种于包被有Ⅳ型胶原的T25培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中，贴壁10-20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；

(13)、再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37℃、5％CO₂的饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次；

(14)、细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；

(15)、培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37℃，5％的CO₂温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml细胞培养液终止消化；

(16)、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；

(17)、将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，继续培养，细胞传至2-5代，即可。

2.根据权利要求1所述的一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述的步骤(7)中，所述的消化液为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基中含有1U/ml中性蛋白酶Ⅱ、40U/ml硫酸庆大霉素、25μg/ml两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述的步骤(9)中，所述的消化液采用DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基中含有体积分数为0.5％Ⅰ型胶原酶、40U/ml硫酸庆大霉素、25μg/ml两性霉素B。

4.根据权利要求1所述的一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述的步骤(11)中，所述的过滤器的孔径为40μm。

5.根据权利要求1所述的一种高效的人皮肤组织多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述的步骤(13)中，所述的细胞培养液为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基中含有体积分数为2％的B-27、20ng/ml EGF、40ng/mlbFGF、40U/ml硫酸庆大霉素、25μg/ml两性霉素B。