[发明专利]一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子

说明书

本发明公开了一种基于转录组测序构建棒状杆菌组成型表达载体启动子的方法，本发明还公开了基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子的表达载体以及该表达载体转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。用本发明获得的启动子构建的表达载体，对数期目的基因蛋白表达量低，但稳定期目的蛋白表达量相对于对数期大幅度提高，且对宿主菌生长影响低，质粒传代稳定性高，适合于对数期不需要表达，而稳定期需要高度表达的目的基因的载体构建，尤其适合于氨基酸发酵用工程菌株的构建。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及棒状杆菌组成型表达载体启动子及其构建方法，本发明还涉及含有所述该启动子的表达载体及重组菌株。

背景技术

棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸和核苷酸等多种化学物质(Liebl等，1991)。经过物理或化学方法诱变处理得到的棒状杆菌突变株具有较强的合成目的有用物质的能力，而通过遗传工程和代谢工程对棒状杆菌野生菌株或突变株进行改造，可以获得具有更高生产强度的菌株。代谢工程改造即是在棒杆菌的多种代谢途径中寻找关键的代谢酶，通过基因工程改造调控关键代谢酶的基因表达。通常基因都是在启动子的控制下表达，其表达强度依赖于启动子元件。来自大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌的启动子能够在棒状杆菌属细菌中表达，可应用于棒状杆菌的载体系统构建，如应用来源于大肠杆菌的Ptac、Ptrc启动子构建的表达质粒PXMJ19，PEC-XK99E，基因在lacI^q的控制下进行诱导表达，但表达量低，且在生产过程中需要添加诱导剂IPTG，而IPTG相当昂贵，不适于用做大规模生产目的产品的基因表达诱导剂；乳糖能够用来替代IPTG作为诱导物应用于大规模的生产，而对于绝大多数的棒状杆菌菌株而言，乳糖都不能进入其细胞中(Brabetz等,1991)，这也限制了诱导型表达系统在棒状杆菌中的应用。

组成型启动子不需诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程、且具有相对较高的安全性，因此更适合在实际生产中应用。在不同细菌的管家基因中应用PCR扩增DNA探针等手段筛选并纯化具有强表达性的组成型基因，筛选出组成型的强启动子，用于重组载体的构建(Jensen P R et al.,Appl EnvironMicrobiol,1998,64(1):82-87.)。杨柳等利用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中的表达(杨柳等，新能源进展，2014,5(2):353-357)，王小元等通过突变得到转录启动功能的tac-M启动子，构建组成型表达载体PDXW-10，在棒状杆菌中，该载体表达外源蛋白的水平适中(CN：200910210962.9)。组成型启动子表达虽然具有很多优点，但目前筛选方法复杂，且如何选择合适的启动子进行调控，以避免因为过量的蛋白表达而导致宿主菌生长停滞或代谢障碍，或使宿主能量耗竭以及质粒丢失是工业化生产亟待解决的问题。目前存在使用如Pgro作为启动子，与目的基因一起构建组成表达型质粒，这类质粒在细菌对数生长期也进行目的基因的表达，导致质粒在稳定期之前丢失严重，从而降低了表达效果。

本发明的目的就是建立一种方法，寻找细菌对数生长期沉默，细菌生长停滞期高效表达的启动基因，用它来构建组成型高效表达质粒。在本发明中，我们应用转录组测序的分析数据，寻找一类能调控目的基因在对数期表达弱，而稳定期大量表达的启动子，一般这类启动子都是可调控型启动子，我们截取这些启动子不同的基因片段，构建了一系列棒状杆菌组成型表达载体，该系列表达载体应用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，探测各启动子片段活性强弱，且考核各探测质粒传代稳定性，从而筛选出一系列对数期启动子活力低、稳定期启动活力高的启动子，并考核含各启动子的质粒传代稳定性，进一步筛选出使质粒稳定的启动子。

发明内容