[发明专利]全血中阿比特龙的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物(包括人)全血中阿比特龙的定量检测方法。

背景技术

前列腺癌是欧美男性常见的一种恶性肿瘤，每年新增诊断人数约为240000，是肿瘤男性死亡率第2的肿瘤，且转移性强。据统计，2012年大约28000人死于该病。虽然我国前列腺癌发病率远低于西方国家，但是随着生活方式的改变，前列腺癌特异抗原筛查的普及，我国前列腺癌的患病人数也呈直线型上升趋势，且其中大多数发展为晚期前列腺癌。其发展的主要机制为细胞内雄性激素受体受到雄性激素的持续刺激，目前对于前列腺癌的首选治疗方法为去势治疗，但研究显示初期显效后平均36个月后很大一部分患者发展为去势抵抗性前列腺癌，经过研究后发现患者在接受治疗后前列腺癌细胞内仍可继续合成少量雄性激素。随后的研究发现，第一代雄激素受体拮抗剂酮康唑可调控雄性激素轴，但是治疗效果短暂，并且酮康唑对于抑制雄性激素合成的耐受性很差。多项研究表明，在血清睾酮达到去势水平，前列腺癌细胞内的雄性激素受体信号轴依然能够保持活性，并对其增殖具有重要影响作用。临床研究证实，去势治疗后血清前列腺癌特异抗原的增加可被二线激素治疗药物所降低，且雄激素受体通路活性与睾酮循环水平无关。

阿比特龙是一种抗雄激素药物，为雄激素代谢过程中的CYP17酶抑制剂，属于内分泌治疗范畴，该药物通过阻断雄激素生物合成的关键酶降低睾酮水平，除了睾丸、肾上腺来源的睾酮外，还可以降低前列腺肿瘤内部微环境中的雄激素合成。阿比特龙可以强烈抑制17α-羟化酶/C17，2-裂解酶(CYP17)，从而显著抑制雄激素的生物合成，在小鼠的药物代谢动力学模型中阿比特龙对于CYP17的抑制活性远远超过酮康唑。I期临床试验结果表明，阿比特龙在去势环境下不仅可以很好地抑制睾酮水平，而且具有很好的耐受性，也没有表现出像酮康唑一样的毒性反应。开放、单中心和剂量递增的临床试验表明持续阿比特龙治疗可以使50％～57％的患者血清中前列腺癌特异抗原降低，且II期临床推荐治疗剂量为1000mg/d，在此剂量下可同时抑制糖皮质激素和雄激素的合成。阿比特龙化学结构式如式1所示。

目前，关于阿比特龙的定量检测与分析，尚未见国内相关文献报道。西南交通大学制药工程学院吴青松等开展了乙酸阿比特龙酯的合成及其质量检测研究，其采用Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长220nm，柱温40℃，流动相A相为甲醇-乙腈(80％-20％)、流动相B相为水，梯度洗脱(洗脱程序见表1)，定量分析了乙酸阿比特龙酯和作为杂质存在的阿比特龙的含量。检测结果显示，阿比特龙与其他杂质分离较好，峰形也非常对称，无前展或拖尾现象。但是该研究是在合成反应提取物中进行的检测，而且样品已经进行了前期净化处理，在反应样品中无蛋白、脂质成分等细胞内生物杂质干扰。

表1.梯度洗脱程序

国外期刊报道了印度Kumar等采用RP-HPLC方法定量分析了大鼠血浆中阿比特龙。该文献显示采用Betasil C18色谱柱，利用乙酸乙酯萃取，室温环境下定量检测了大鼠血浆中阿比特龙含量。其回收率为70％以上，流动相为乙腈-水-0.01M磷酸二氢钾(pH3.0)＝55-5-40(V/V/V)。

根据文献可知，动物血浆中阿比特龙HPLC检测能够定量分析生物样品中阿比特龙含量，结果定量准确、灵敏、重复性好，日内和日间变异系数较小，能够满足动物体内阿比特龙药物代谢动力学研究。然而该研究只是定量分析了动物血浆中阿比特龙含量，动物血浆为去除红细胞、白细胞、淋巴细胞等细胞成分的一类生物样品，细胞内大量的生物杂质已经被清除，从而使得血浆样品相比已经比较干净。因此，目前的研究只是定量检测了血浆或血清中阿比特龙含量，尚未得知血液中所含的各类血细胞(包括红细胞、白细胞等)中阿比特龙含量，也难以求出全血中阿比特龙含量。血细胞作为药物的一个重要储库和缓冲器，有时候需要全面评价药物在血细胞中的分布特征，从而在联合用药方面保证协同活性，降低联合用药的副作用。因此，获知全血中阿比特龙含量有其特定作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种全血(包括血浆和血细胞)中阿比特龙含量的准确、定量检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种全血中阿比特龙的定量检测方法，以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：