[发明专利]KARS基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供KARS基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用，KARS基因点突变小鼠模型的构建方法包括如下步骤：步骤一：靶点构建，寻找与神经系统疾病相应的基因，并进行靶点设计；步骤二：设计Guide‑RNA/Cas9mRNA，并且制备成质粒，转录后显微注射到受精卵细胞质中；步骤三：Founder小鼠鉴定；步骤四：F1代小鼠鉴定。本发明的构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法及其应用，由于针对KARS基因的定点突变来进行，使得模型小鼠的疾病研究能够在与真实疾病的发生和发展更加接近的条件下进行，其研究的结果更具参考价值。

技术领域

本发明涉及一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，本发明还涉及KARS基因点突变小鼠模型的应用，属于动物模型领域。

背景技术

认知是机体认识和获取知识的智能加工过程，涉及学习、记忆、语言、思维、精神、情感等一系列随意、心理和社会行为。认知障碍指与上述学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常，从而引起严重学习、记忆障碍，同时伴有失语或失用或失认或失行等改变的病理过程。

目前，认知障碍的小鼠模型主要采用血管性痴呆和阿尔兹海默病两种类型。血管性痴呆由于急慢性脑缺血缺氧，引起脑组织损伤，可导致脑功能减退，认知功能下降。其中，针对大动脉的主要模型构建方法有血管阻断法和血管栓塞法，微小血管损伤的模型有易卒中自发性高血压大鼠(SHRSP)，伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病CADASIL动物模型(Notch3转基因鼠)等。阿尔兹海默病的模型常见的有：①通过局部毁损动物大脑胆碱能系统导致其记忆和认知功能障碍；②脑内注射β淀粉样蛋白局部模拟AD；③转基因动物模型如APP转基因模型、PS转基因模型、tau转基因模型等。然而，上述的动物模型并不十分成熟，用手术方式构建模型对动物打击较大，术中死亡率较高，术后也难以长期存活，不利于观察研究。AD的转基因模型仅能代表某些病理、生理，也很难充分再现阿尔兹海默病的复杂特性。如何找到一种更贴近自然发生方式的动物模型的构建方法，是当前对认知障碍进行研究亟待解决的问题。

发明内容

我们的研究发现，KARS基因的异常突变与认知障碍有关。构建KARS基因突变小鼠模型，可以帮助研究者深入了解KARS的其他生物学功能，为探索KARS功能与认知障碍的相关性提供有效的研究途径和方法，并由此提供其应用。通过CRISPR/Cas9方法构建一种新型的、稳定性高、重复性好的KARS基因突变小鼠模型，有望深入研究疾病的损伤机制，从而找到延缓认知障碍发生发展的新方法。

本发明的目的在于提供一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法以及KARS基因点突变小鼠模型的应用。

本发明采用了如下技术方案：

一种构建具有神经系统疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：靶点构建

1)寻找KARS基因的CDS区，明确外显子部分，点位：R504H；

2)靶点设计；

步骤二：获取受精卵，并进行显微注射；

1)Guide-RNA，Cas9RNA转录；

2)纯化转录产物；

3)将Guide-RNA/Cas9 mRNA显微注射到受精卵细胞质中；

步骤三：将受注射过Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵进行培养，然后进行胚胎移植；

步骤四：Founder小鼠鉴定：

提取出生的胚胎移植小鼠的DNA，进行PCR鉴定；

步骤五：F1代小鼠鉴定，将Founder小鼠与野生型小鼠交配，生出的小鼠为F1代，若F1代中有阳性小鼠出生，表明相关品系小鼠模型构建成功。