[发明专利]KARS基因点突变小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：靶点构建

1)寻找KARS基因的CDS区，明确外显子部分，点位：R504H，KARS基因Gene Bank GeneID:85305，

2)靶点设计；

步骤二：获取受精卵，并进行显微注射

1)Guide-RNA，Cas9RNA转录，

2)纯化转录产物，

3)将Guide-RNA/Cas9 mRNA显微注射到受精卵细胞质中；

步骤三：将受注射过Guide-RNA/Cas9 mRNA的受精卵进行培养，然后进行胚胎移植；

步骤四：Founder小鼠鉴定

提取出生的胚胎移植小鼠的DNA，进行PCR鉴定；

步骤五：F1代小鼠鉴定

将Founder小鼠与野生型小鼠交配，生出的小鼠为F1代，若F1代中有阳性小鼠出生，表明相关小鼠模型构建成功；

步骤六：P532S位点突变的小鼠的建立；

步骤七：KARS R504H/P532S双位点复合杂合突变，

将R504H纯合子突变小鼠与P532S纯合子突变小鼠杂交，得到杂合突变小鼠。

2.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，其中，

与KARS基因的点位R504H相对应的sgRNA的DNA序列是：

ccccagGCACCGCTCCAAAGAGG，

将野生型基因中CGC突变为CAC的模板DNA是：KARS-R504H-120bp-oligo:ggtattgcattatgagagctctgaatattcatcctctgtggtctcgcgtccccagGCACCACTCCAAAGAGGGTCTCACGGAGCGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCA，其中下划线部分的三个碱基为突变位点。

3.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，其中，

对Founder小鼠进行鉴定所用的鉴定引物是：

KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA；

KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。

4.如权利要求1所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：

其中，P532S的sgRNA的DNA序列为：KARS-P532S-sgRNA-S:CTGAGCTGAATGACCCCGTGCGG，

和/或

KARS-P532S-sgRNA-2S：ACAGCTGCCTCTGCCGCACGGGG，

将野生型基因中CGC突变为CAC的模板DNA是

KARS-P532S-120bp-oligo:

CGCTTTGAGCTGTTTGTCATGAAGAAGGAGATATGCAATGCCTATACTGAGCTGAATGACTCCGTGCGGCAGAGGCAGCTGTTTGAGGAGCAGGCCAAGgtgagtgagtgagtgagacta，其中下划线部分的三个碱基为突变位点。

5.如权利要求4所述的KARS基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：

对P532S位点突变的小鼠进行鉴定的鉴定引物是：

KARS-PCR-S:CAGGCATCCCAAAAGAACAA，

KARS-PCR-A:GCTTAGGTAAAACACCAAGAAA。