[发明专利]一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光PCR方法

说明书

本发明涉及一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物，包括表1中所示的SEQ ID No.1‑15的序列引物序列或探针序列；所述各探针序列的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团；所述报告基团有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬灭基团有：TAMRA，BHQ、Eclipse。本发明的一种五重实时荧光定量PCR的检测方法，可在同一反应体系中，同时检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌五种致病菌。且运用五重实时荧光定量PCR法对这五种致病菌进行检测，可提高检测的灵敏度、特异性、并可大幅度的提高检测效率，弥补了常规检测所存在的步骤复杂、检测周期长，不能适应大规模快速检测的缺陷。

技术领域

本发明涉及一种快速、同时检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的引物探针组合物以及多重实时荧光PCR的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)、创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)、志贺氏菌(ShigellaCastellani)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是五种常见的食源性致病菌，也是我国食品国家卫生标准中致病菌检测的5项重要指标。其中沙门氏菌是是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。创伤弧菌广泛分布在海水中，可从牡蛎等海产品中分离得到。本菌主要通过伤口接触海水造成感染，也可经口感染。经伤口感染时可导致蜂窝织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。感染本菌后如不及时治疗，病死率很高。志贺氏菌通称痢疾杆菌，是引起人类细菌性痢疾的主要病原菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。现阶段国家标准中对上述致病菌的检测主要依靠传统的细菌培养、生化鉴定的方法，步骤复杂、检测周期长，已不能完全适应大规模快速检测的需要。近些年来，随着分子生物学的发展，PCR和实时荧光定量PCR技术逐渐走进食品中致病菌的检测。而且实时荧光定量PCR与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期短、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。由于多重实施荧光定量PCR引物之间的交叉影响，Mg²⁺的浓度、不同引物探针所需添加量的不同等因素的存在。致使现阶段运用实时荧光定量PCR检测多是单重实时荧光定量PCR检测法，可同时检测多个目的基因的检测体系较少，因此，建立一种以多重实时荧光定量PCR为基础的食品中沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的快速同时检测方法是具有实践意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同时鉴别沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的引物探针组合物，该组合物能快速的鉴别沙门氏菌的特异性invA基因、创伤弧菌的特异性vvhA基因、志贺氏菌的特异性ipaH基因、金黄色葡萄球菌的特异性nuc基因，单增李斯特菌的特异性prfA基因，特异性强，灵敏度高。