[发明专利]一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法

说明书

本发明公开了一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法，属于香鳞毛蕨遗传转化技术领域。本发明所提供的方法为是以香鳞毛蕨配子体为受体，用植物双元表达载体转化农杆菌，将经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于转化后的农杆菌菌液中侵染，除菌后进行延迟培养，最后对目标基因进行检测，筛选后得到具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。该方法过程简单，操作方便，成本低廉，能在较短的时间内完成香鳞毛蕨遗传转化体系的建立，为今后进一步研究相关基因合成和调控的特性，转入抗性基因，创新蕨类植物的种质资源和遗传转化奠定基础。适用于香鳞毛蕨的遗传转化。

技术领域

本发明涉及一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法，属于香鳞毛蕨遗传转化技术领域。

背景技术

香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans(L.)schoot.)是一种重要的药用植物，由于其对皮肤病有很好的疗效，逐渐被人们重视。目前国内外对香鳞毛蕨的研究主要集中在其药用成分、药理作用、形态解剖学以及资源分布研究比较多，而对于分子生物学方面的研究比较少。在蕨类植物中进行遗传转化却非常困难，因为蕨类植物的生活史有明显的世代交替现象，生长周期较长，目前，在蕨类植物中只有水蕨建立了转化体系，其他蕨类植物的转化体系尚未研究，且对于蕨类植物而言农杆菌介导的转基因还没有成功的例子，目前在蕨类植物中进行遗传转化可行的方法就是利用基因枪法，但是到目前为止依然没有办法得到稳定的转化效果。韩静丹(2012)对铁线蕨的转基因的两种方法进行了研究，结果表明，农杆菌介导的遗传转化由于再生过程中抑菌剂的影响致使材料褐化率高，难以继续分化；而基因枪法由于在轰击过程中受到较大程度的污染，致使材料在再生过程难以继续生长，均未能建立稳定的再生体系。但近几年，国外用水蕨的配子体和愈伤组织为受体材料，利用基因枪和农杆菌介导法成功的将外源基因导入到受体细胞内，所以建立蕨类遗传转化体系成为可能。目前关于香鳞毛蕨转基因的研究尚未报道，还没有建立一个高效、稳定的遗传转化体系，更没有找到一种比较成熟的香鳞毛蕨遗传转化体系的建立方法。

发明内容

为建立一种高效、稳定的香鳞毛蕨遗传转化体系，本发明提供了一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法，该方法包括以下步骤：

1)预培养：将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养；

2)农杆菌菌液的制备：用植物双元表达载体转化农杆菌，然后将含有植物双元表达载体的农杆菌扩大培养后收集菌体，重悬后获得农杆菌菌液；

3)农杆菌菌液的浸染；将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染；

4)除菌和延迟培养：除菌后进行延迟培养；

5)检测筛选：最后对目标基因进行检测，筛选后得到具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。

优选地，步骤1)所述预培养的时间为0d-3d。

优选地，步骤2)所述植物双元表达载体上质粒携带有GUS报告基因，CaMV启动子和筛选标记基因。

更优选地，步骤2)所述植物双元表达载体为PBI 121。

优选地，步骤1)所述农杆菌为LB4404。

优选地，步骤1)所述农杆菌菌液的OD₆₀₀＝0.5-0.6。最优为0.5。

优选地，步骤3)所述侵染，时间为10min-15min。最优选为10min。

优选地，步骤4)所述除菌是将经过农杆菌浸染后的配子体用200mg/L-500mg/L的头孢霉素无菌水清洗后，接种到含有200mg/L-300mg/L头孢霉素的培养基上。