[发明专利]高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清及其制备方法及应用

说明书

技术领域

一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，属于免疫技术领域。

背景技术

眼镜蛇(Naja naja atra Cantor) 属于眼镜蛇科、眼镜蛇属，在我国分布广泛，是神经型毒蛇, 其主要毒素为神经毒素。神经毒素分为二类：突触前神经毒素和突触后神经毒素，前者抑制神经传导中乙酰胆碱的释放，后者能够与运动终板乙酰胆碱受体结合，二者都导致神经传导阻断。二类神经毒素都为碱性蛋白，不含非蛋白成分，分子量小，含4-5个二硫健，耐热性很强。

由于眼镜蛇毒神经毒素的稳定性很强，一般的减毒方法很难改变其毒性，在制备神经毒素抗血清过程中，注射的抗原量很少动物才能存活，抗原量小导致抗血清效价低，治疗效果不佳。制备高效价抗血清对于有效治疗眼镜蛇咬伤、降低死亡率有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清及其制备方法，本发明利用眼镜蛇毒神经毒素耐高温的特点,加热后离心获得神经毒素,将神经毒素用SDS和β-巯基乙醇处理降低神经毒性，并包埋在聚丙烯酰胺凝胶中减少释放速度，将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，获得高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清。

本发明的具体技术方案如下：

一种高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：

a、按照0.08-0.12g眼镜蛇毒用0.8-1.2 mL 生理盐水溶解，沸水浴中加热8-12分钟，离心去除非神经毒素沉淀，然后加48-52 mg SDS和1.8-2.2 uL β-巯基乙醇充分混合减弱其神经毒性；

b、神经毒素的包埋： 将经过减毒处理的神经毒素包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；

c、将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，经几次免疫注射后，以切断颈动脉方式杀死家兔取血， 离心获得抗血清。

所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法，其特征在于,步骤c所述的免疫注射家兔的具体操作方：将含神经毒素的凝胶磨细后免疫注射家兔，进行4次免疫注射，每次注射间隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后，第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清。

所述的高效价的抗眼镜蛇神经毒素血清的制备方法制得的抗血清。

所述的抗血清在治疗眼镜蛇咬伤患者上的应用。

本发明技术效果体现在二个方面：

1、保证制备抗血清的高效价

由于神经毒素活性大部分被抑制，注射量增加，被注射动物不会因为神经毒素的作用而死亡，保证了制备的抗血清效价高。通过比较，本发明比传统方法制备的抗血清效价高出约7倍，治疗效果大大提高；

2、不使用昂贵的福氏佐剂，降低抗血清的生产成本。

本发明将神经毒素包埋在网状的聚丙烯酰胺凝胶中，神经毒素从网状的聚丙烯酰胺凝胶中缓慢释放到动物体内，抗原在动物体内停留时间长，能充分刺激免疫系统，而且用聚丙烯酰胺凝胶替代了昂贵的福氏佐剂。

具体实施方式

实施例一：

第一步：眼镜蛇神经毒素的获得

将0.1g 眼镜蛇毒溶解于1.0 mL 生理盐水，沸水浴中加热10分钟，离心（13000转/分）去除非神经毒素沉淀，然后加50 mg SDS和2 uL β-巯基乙醇充分混合减弱其神经毒性；

第二步：神经毒素的包埋

将上述神经毒素溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %过硫酸铵、2uL 四甲基乙二胺(TEMED)，充分混匀，沿试管壁缓慢加入0.5mL 异丙醇，1 小时后凝固，去除异丙醇，取出胶体用手术刀平均分成4份，每份约1 g，冷冻保存；

第三步：注射免疫家兔，获得抗血清

取1份上述胶体，加2.0 mL生理盐水，于研钵内充分磨细，吸入到5mL规格的一次性注射器中，总体积约3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次免疫间隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL,腹腔注射2.25mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。

第四步：抗血清效价的测定

抗血清效价的测定与ELISA方法相似。