[发明专利]一种黑木耳SSR‑PCR的优化反应体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑木耳SSR分子标记的反应体系的优化。

背景技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传变异的直接反映。随着分子生物学技术的发展，目前已经开发了几十种基于DNA 多态性的分子标记，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STS、SNP、SCAR、CAPS 等，但是，RFLP 标记所需 DNA量大，步骤多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，成本高；RAPD标记因使用的引物较短，对反应条件极为敏感，稍有改变便影响扩增产物的重现，重复性较差，稳定性不好。另外，RAPD 是显性标记，不能区分纯合与杂合基因型，无法直接用于基因型分析；AFLP标记对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高，方法复杂，条带多且密集，使统计分析困难，且费用比较昂贵；SNP 提供的信息较少，且费用较高。相比之下SSR标记具有以下优点：等位基因变异多，信息含量高；单基因座，多态性高；以孟德尔方式分离、呈共显性遗传；种族特异性强、进化所受选择压小，在种属间有良好的通用性；对 DNA 质量要求低，用量少，即使是部分降解的样品也可进行分析；可利用PCR进行分析，操作简便，稳定性、重复性好。基于上述特点，SSR已成为在生物上应用最广、最为重要的分子标记。与其他分子标记一样，SSR标记需配置大量的PCR反应体系进行扩增，但与其他分子标记不一样的是SSR分子标记一般用丙烯酰胺凝胶检测而非琼脂糖凝胶检测，点样量较少，如配置与其他分子标记相同的PCR反应体系过多将造成严重的浪费。

发明内容

本发明提供一种黑木耳SSR-PCR的优化反应体系，以解决目前SSR分子标记反应体系过大，各种试剂用量过多而造成浪费和成本较高的问题。

本发明采取的技术方案是：SSR分子标记反应体系采用的10ul体系，其中：

10×Taq DNA聚合酶Buffer缓冲液（含Mg+） 1×1.0uL

2.5mmol/L dNTPs 混合溶液(2.5mmol/L)0.25mmol/L 1.0uL

10uLmol/L上游引物0.2mmol/L0.2uL

10uLmol/L下游引物0.2mmol/L0.2uL

DNA模版20ng～50ng 1.0uL

其余为Taq DNA聚合酶1.0U和水。

本发明的优点：在不影响实验结果的情况下将黑木耳SSR-PCR反应体系由20ul优化减半为10ul,减少了试剂使用量，避免试剂不必要的浪费，大大降低实验成本。

附图说明

图1 普通20ul SSR-PCR反应体系电泳图；

图2 优化10ul SSR-PCR反应体系电泳图。

具体实施方式

SSR分子标记反应体系采用的10ul体系，其中：

10×Taq DNA聚合酶Buffer缓冲液（含Mg+） 1× 1.0uL

2.5mmol/L dNTPs 混合溶液(2.5mmol/L)0.25mmol/L1.0uL

10uLmol/L上游引物0.2mmol/L 0.2uL

10uLmol/L下游引物0.2mmol/L 0.2uL

DNA模版20ng～50ng1.0uL

其余为Taq DNA聚合酶1.0U和水。

以优化的反应体系进行黑木耳菌株SSR分子标记试验按以下步骤实现：

一、提取选定黑木耳菌株菌丝体总DNA；

二、按比例配制黑木耳SSR优化PCR反应体系；

三、进行PCR反应；

四、PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

下边通过对比效果实验进一步说明本发明。

1 黑木耳菌株菌丝体总DNA提取：

1.1 称取0.2g菌丝，置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末。

1.2 将菌丝粉末迅速转入2.0mL离心管中，加入900uL 65℃预热的CTAB提取缓冲液。

1.3 置于65℃水浴40min～60min,不时轻轻地摇动混匀。

1.4 12000rpm 离心10min，将上清转移至已灭菌的2.0mL离心管中，弃沉淀。

1.5 加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液，轻轻摇匀，室温静置5min。

1.6 12000rpm 离心10min，观察分界面有无沉淀，将上清转移至已灭菌的2.0mL离心管中，弃下层有机相。