[发明专利]乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎是一个由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的重大的全球健康问题。HBV感染引起的慢性乙肝可能发展成肝硬化和肝细胞癌。最近有报道称全球大约有2.48亿人患有慢性乙肝(Chronic hepatitis B，CHB)。慢性乙肝的血清学分类非常复杂，按照血清e抗原水平可将其分为e抗原阳性和e抗原阴性慢性乙肝感染。近年来全球HBV的感染人数有所下降，但其中HBeAg阴性感染数量越来越多。但目前对e抗原阴性病人对抗病毒疗法响应率低，导致处理时间增加，此外，e阴性慢性乙肝患者发展为肝细胞癌的几率更高。因此，对e阴性HBV的发展史和致病机理需要更深层次的研究。而目前对慢性HBV感染和治疗的研究主要是基于e阳性动物模型展开的，到目前为止，世界范围内仍无一例对e阴性HBV感染动物模型的研究和报道，目前对e阴性HBV感染的研究仅限于致病机理、药物处理和药物筛选。因此，目前急需一个能够用于e阴性HBV持续感染研究的动物模型。

发明内容

本发明的目的针对上述问题提供一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

1)提取被诊断为HBeAg阴性感染的病人血清DNA，使用引物对HBV-F/HBV-R进行PCR扩增，引物序列为：

HBV-F：5′-CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC-3′，

HBV-R：5′-CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG-3′；

2)将PCR产物进行测序，根据测序结果重新设计针对该序列的特异性PCR扩增引物对，利用该引物对HBeAg阴性感染的病人血清DNA重新进行PCR扩增；

3)将步骤2)获得的PCR产物克隆到pEASY-Blunt Zero载体中，挑选阳性克隆；

4)提取步骤3)中阳性克隆的质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约3.2kb的的片段并纯化，用T4连接酶将其环化并纯化，得到HBV e阴性的cccDNA；

5)将步骤4)得到的cccDNA注射入小鼠中，即构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。

在上述技术方案中，步骤2)中所述的引物对为HBV-VF/HBV-VR，序列为：

HBV-VF：CCGGATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC，

HBV-VR：CCGGATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG。

步骤5)中采用水动力法将cccDNA注射入小鼠中。

在步骤5)中，每只小鼠注射2μg cccDNA，cccDNA的浓度为1μg/mL，注射时间为5～8s。

本发明的有益效果是：首次成功的构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型，解决了目前只有乙肝e阳性动物模型而没有e抗原阴性动物模型的问题。本发明构建的乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型可以用于e阴性HBV持续感染研究，对e抗原阴性乙肝感染的机理研究和药物处理疗效研究具有重要意义。

附图说明

图1是HBV病毒特异标志物在小鼠血清中的表达图，其中，A为高压水动力注射后血清HBsAg的表达水平，B为注射后不同时间点血清中HBsAg阳性结果的百分比，C为血清中HBV DNA的水平，D为注射后血清HBeAg的表达水平。

图2是肝组织中HBVDNA表达的qPCR检测结果图。

图3是滚环扩增-PCR法检测cccDNA的结果，其中，1：100bp ladder，2：pEASY-HBV/HBeAg-阴性质粒作为模板，3：线性HBV作为模板，4：注射后21天的实验组提取的DNA作为模板，5：注射后21天的实验组提取的DNA作为模板，6：cccDNA作为模板。

图4是注射后21天和70天小鼠肝组织HBcAg的IHC检测结果，其中，a、b、c分别是注射后21天的肝组织IHC结果，a为生理盐水，b为pAAV/HBV1.2，c为环化的HBV DNA；d、e、f分别是注射后70天的肝组织IHC结果，d为生理盐水，e为pAAV/HBV1.2，f为环化的HBV DNA。