[发明专利]刺苋的实时荧光PCR鉴定方法

说明书

本发明公开了一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，该方法包括以下步骤：步骤1，取样本2g，液氮研磨至粉末状，取0.2g研磨后的粉末状样品用试剂盒提取DNA，将提取到的DNA溶解在50μL去离子水中，将得到的DNA样品置于‑20℃冰箱保存、备用；步骤2，基于叶绿体的PsbA基因，设计并合成具有刺苋特异性的引物和探针，步骤3，TaqMan实时荧光PCR：将步骤2设计合成的引物和探针对步骤1中的DNA样品进行荧光PCR扩增反应，通过荧光PCR扩增后得到Ct值对样品是否含有刺苋进行判定。本发明利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性的片段，有效解决形态学鉴定的不足。

技术领域

本发明属于刺苋的鉴定方法，具体涉及一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法。

背景技术

入侵生物的传播途径主要有3种：一种是有意识引进，即人为引进具有一定经济价值、实用价值的物种，最后演变为入侵种；二是无意识引进，即随着贸易、运输、旅游等活动而传入的物种演变而成的入侵种；三是自然入侵，即通过物种自身的扩散能力或者借助自然条件而实现的入侵。据悉，中国外来入侵植物中约50％是由于检疫人员疏漏，随贸易品、运输工具等方式引进，即无意识引进。但随着贸易全球化，人为活动范围的扩大，进出口贸易量的与日俱增，无疑对检疫工作提出了更高的要求。而检疫工作中面临的业务量大、鉴定专家匮乏也是实际存在的困难。

据调查研究显示，中国外来入侵植物约500种，主要集中在菊科(Compositae)、豆科(Leguminosae)、禾本科(Gramineae)等几个科中，优势属中较为突出的是苋属(Amaranthus)。苋属植物作为粮食、蔬菜、观赏以及染料植物，对生态环境、人类活动等产生积极影响，但该属的刺苋(A.spinosus)、反枝苋(A.retroflexus L.)、长芒苋(A.palmeriS.Watson)等属于杂草，具有感化潜力，特别是刺苋，对生长在其周围植物的萌发和光合速率都会有一定的影响，降低多种作物的生长和产量。

目前植物物种鉴定通常以传统的形态学鉴定为主，若植物以种子、果实等形态出现，或形态学信息不足等都会使鉴定面临困难。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，本发明利用分子生物学手段，通过检测物种DNA序列中特异性的片段，解决形态学鉴定的不足。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种刺苋的实时荧光PCR鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：

步骤1，刺苋DNA提取：

取样本2g，液氮研磨至粉末状，取0.2g研磨后的粉末状样品用试剂盒提取DNA，将提取到的DNA溶解在50μL去离子水中，将得到的DNA样品置于-20℃冰箱保存、备用；

步骤2，特异性引物和探针的设计与合成：

基于叶绿体的PsbA基因，设计选取具有刺苋特异性的引物和探针，所述特异性引物和探针分别为：

F：TAAAGGAGCAATGCCGTTTTCTT，

R：CAGTATTCAGAACTTGCCTTTGA，

P：FAM-TTTTTTTTTTAATTCAAAATGGATTCAAGAT–Eclipse，

步骤3，TaqMan实时荧光PCR：

将步骤2设计选取的引物和探针对步骤1中的DNA样品进行荧光PCR扩增反应，通过荧光PCR扩增后得到Ct值，通过Ct值对样品是否含有刺苋进行判定。

所设计的引物和探针对刺苋具有物种的特异性，能用于刺苋的鉴定。