[发明专利]淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为埃希氏菌属的代表菌种，广泛存在于自然界中，其中致病性大肠杆菌(比如肠出血性大肠杆菌EHEC)能释放强烈的毒素，并可能导致人和动物出现严重症状，如带血腹泻。世界各国及国际组织都将大肠杆菌作为重要卫生与环境安全指标：世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定,所有用于饮用的水中大肠杆菌不得检出；美国饮用水标准规定，一级水质中大肠杆菌不得检出；中国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》也规定,总大肠菌群及粪大肠菌群不得检出。

目前,国际上公认的大肠杆菌标准检测方法以多管发酵法和滤膜法为主，即先根据其培养特性生物学特性进行初步鉴定，然后根据生化试验进行最终的确诊。上述方法检测周期长,操作繁琐,难以适应污染源快速诊断的需要。近年来,基于核酸技术的分子生物学方法得到了快速发展。由于研究结果表明，肠出血性大肠杆菌携带的主要毒力基因为Stx1和Stx2(Ojo,O.E.,Ajuwape,A.T.P.,Otesile,E.B.,Owoade,A.A.,Oyekunle,M.A.,Adetosoye,A.I.Potentially zoonotic shiga toxin-producing escherichia coli serogroups in the faeces and meat of food-producing animals in ibadan,nigeria.International Journal of Food Microbiology，2010，142，214-221)，许多以其为识别位点的PCR方法(Khatami,F.,Heidari,M.,Khatami,M.Rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 by fluorescent amplification-based specific hybridization(FLASH)PCR.Iranian Red CrescentMedical Journal,2012,14,594-598；Son,I.,Binet,R.,Maounounen,L.A.Detection of five Shiga toxinproducingEscherichia coli genes with multiplex PCR.FoodMicrobiology,2014,40,31-40)和环介导等温基因扩增方法(Wang,F.,Yang,Q.,Qu,Y.,Meng,J,Ge B.Evaluation of a loop-mediatedisothermal amplification suite for the rapid,reliable,androbust detection of Shiga toxin-producing Escherichia coliinproduce.Applied and Environmental Microbiology,2014,80,2516-2525；Wu,L.,Song,Y.,Luan,T.,Ma,L.,Su,L.,Wang,S.,Yan,X.Specific detection of liveEscherichia coliO157:H7using tetracysteinetagged PP01 bacteriophage.Biosensors and Bioelectronics,2016,86,102-108)已经建立和应用。较之于传统方法，基于核酸扩增的分子生物学方法检测更为快速、灵敏、简单。然而，目前基于核酸扩增的分子生物学方法全部基于目标细菌的DNA提取，必需离心机等贵重辅助仪器，因而无法实施野外现场测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法，所述方法工作原理为：调节水样酸度，使游离DNA吸附富集在功能膜上，然后采用环介导等温基因扩增技术鉴定Stx1基因的定性信息，从而实现快速筛选出阳性淡水样品。

本发明是通过以下步骤来实现：

一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法，步骤包括样品收集、预过滤、富集游离DNA、清洗和环介导等温基因扩增鉴定五个步骤。

进一步，所述的样品收集步骤，指原位收集不少于1.0L的待测定淡水；

进一步，所述的预过滤步骤，采用水系微孔滤膜过滤所收集的淡水样品，除去不溶性物质；