[发明专利]针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法

说明书

本发明公开一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，包括取材与固定、清洗和染色、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、展片和贴片、脱蜡与封片等步骤。采用本发明提供的方法，能有效处理因香石竹外植体叶芽和花芽材料过大，切片不完整、不连续、存在空洞的问题。可以良好的固定组织发育的各个时期，能够观察到叶芽和花芽发育的整个过程，且操作简单，具有很好的开发应用价值。

技术领域

本发明涉及一种植物石蜡切片的方法，尤其是针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法。

背景技术

石蜡切片是用于观察细胞组织的形态结构的主要方法，而且也已相当广泛地用于许多学科领域的研究中。石蜡切片制作程序及环节繁多，周期长，每个环节都会影响切片质量，常见的问题如材料破碎、切片不完整、不连续、存在空洞。

材料破碎的原因追溯到石蜡制作过程的许多步骤，包括脱水、透明、透蜡、包埋、切片、脱蜡及封片等等，只要其中一个步骤出错，都可能导致材料破碎。其中脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等步骤涉及试剂浓度、成分比例、浸泡时间等因素，切片和染色等过程涉及实际的技术问题。

香石竹叶芽和花芽由于材料特别大，芽的长度可达2～3厘米左右，制作过程就会带来相当大的困难。首先，脱水过程较不容易，由于材料过大而脱水不彻底，会形成空洞蜡片，其次，透明过程会出现问题，二甲苯进入组织比较困难，但又不能以单纯延长二甲苯浸泡时间来达到目的，因为浸泡时间过长，会给材料带来不利的影响，会造成材料脆性增大，组织易碎等。所以较大的芽石蜡切片制作常会出现材料破碎，导致切片制作失败。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法。

本发明通过下列技术方案实现：一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，包括以下步骤：

（1）取材与固定：

取不同发育时期的香石竹叶芽或花芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液（福尔马林:冰醋酸:70％乙醇＝1:1:18）中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；

（2）清洗和染色：

将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次2～5min；再置于2mL离心管内，以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次2～5min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；

（3）脱水：

以浓度为70v/v%的乙醇脱水12～24h，弃乙醇，将材料放入2mL离心管内以2000～3000转/分钟进行离心分离1～2min，换新的2mL离心管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换新的2mL离心管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，将材料放入10mL离心管内；

（4）透明：

加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯后浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；

（5）浸蜡与包埋：