[发明专利]一种离心式固相酶切柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明提供了一种离心式的固相酶切柱的制备方法和用途。本发明属于生物技术领域，尤其涉蛋白质分子的酶解和分析。

背景技术

随着蛋白质组学研究的兴起，蛋白质的精细分析越来越引起研究者的兴趣。蛋白质组学(Proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用, 是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学, 其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。

质谱分析包括质谱检测、软件程序分析及数据库检索. 质谱分析可以对蛋白质的分子量进行准确测定. 通过数据库检索,质谱分析可以比较被检蛋白的多肽质谱与数据库中蛋白的多肽质谱,并以此为根据对被检蛋白进行鉴定. 而且,质谱分析还可检测到蛋白消化后形成的多肽的氨基酸序列,再通过数据库检索对蛋白进行鉴定. 质谱分析所获得的蛋白氨基酸序列是对蛋白进行鉴定的最准确而有效的手段。

而对于蛋白质的质谱分析来说，蛋白的基团越大,质谱检测的准确率越低. 因此,在质谱检测之前,须将蛋白消化成小分子的多肽,以提高质谱检测的准确率. 一般而言,6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测. 现今最常用的酶为胰蛋白酶( t rypsin) , 它于蛋白的赖氨酸( lysine) 和精氨酸( arginine) 处将其切断. 因此,同一蛋白经胰蛋白酶消化后,会产生相同的多肽.利于分析和比较。除了胰蛋白以外，胃蛋白酶、碱性蛋白酶等在蛋白质分析中也有所应用。

目前对于蛋白质在质谱前的酶切处理，常用的方法是在蛋白质溶液中加入蛋白酶溶液，在适当的温度进行酶解反应。酶解反应完全以后加热灭活蛋白酶。然后目的蛋白的酶解产物和灭活的蛋白酶同时进入质谱仪进行质谱分析。

目前方法的缺点在于

1.目前蛋白酶酶解方法用时太长，通常的酶解时间都要在20小时左右，才能够保证目的蛋白的充分酶解

2.目前方法的蛋白酶用量较大，因为无法将蛋白酶与酶切产物分离，蛋白酶是一次性使用。因此带来的酶的成本很高

3.灭活的酶与目的蛋白酶解后的肽段同时进入质谱中，蛋白酶分子会对目的蛋白的分析造成一定的影响。

相对于传统方法，本发明的优点在于

1.本发明采用了高酶活的蛋白酶固定于固相载体上，有效的提高了酶切效率。整个酶切反应在30分钟内完成

2.装填在离心柱中的固定化蛋白酶可以方便的与酶切产物分离。使蛋白酶可以重复利用，大幅度降低了酶切的成本

3.装填在离心柱中的固定化蛋白酶可以方便的与酶切产物分离。使酶切产物中不带有蛋白酶的组分。不会对目的蛋白的分析造成影响。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种离心式的固相酶切柱及其制备方法和用途

1.一种离心式的固相酶切柱，其特征在于该固相酶切柱包括一个离心柱组件及装填在其中的固定有蛋白酶的填料

2. 根据权利要求1所描述的离心柱组件，其特征在于包含一个离心柱以及一个离心柱套管

3.根据权利要求2描述的离心柱，其特征在于离心柱柱管包括柱体、上盖、筛板、密封圈和下堵头

4.根据权利要求3描述的离心柱柱管，其特征在于，柱管材料包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等。其中优选聚丙烯材料

5.根据权利要求3所描述的离心柱筛板，其特征在于，筛板材料包括但不限于聚丙烯，混合纤维或者超高分子量聚乙烯。其中优选超高分子量聚乙烯

6.根据权利要求3所描述的离心柱筛板，其特征在于筛板孔径在1-200μm之间，其中优选5-100μm

7.根据权利要求3所描述的密封圈，其特征在于密封圈外径与离心柱柱体内径一致，或稍大于柱体内径，以保证密封效果

8. 根据权利要求3所描述的下堵头，其特征在于下堵头为一个帽型设计，下堵头的内径与柱体出口的外径一致以保证密封效果

9.根据权利要求3所描述的离心柱上盖，其特征在于上盖与柱体连为一体，且上盖规格与柱体进液口相匹配。盖上上盖后不会有液体漏出

10.根据权利要求2所描述的离心柱套管，其特征在于，离心柱套管的材质包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等，其中优选聚丙烯

11.根据权利要求2所描述的离心柱组件，离心柱套管的内径小于柱体最粗处的外径，以保证离心时，离心柱不会陷入离心柱套管内