[发明专利]一种α‑gal表位修饰试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物医疗技术领域，尤其涉及的是一种α-gal表位修饰试剂盒及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗的主要目标是刺激免疫系统对肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)做出免疫应答，消灭原发灶及转移灶的肿瘤细胞。由于大多数的TAA没有被人们所认识，而自体肿瘤细胞包容了所有自身肿瘤抗原，因此，自体肿瘤细胞被认为是发展肿瘤疫苗的潜在来源。现阶段，应用免疫反应来杀伤自身肿瘤细胞的一个重要的限制性因素是自身免疫系统缺乏对TAA肽的识别，因而不能将肿瘤细胞有效的呈递给抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,APCs)。这是因为自体肿瘤细胞是由机体正常的细胞变化而来，通常缺乏将其自身直接呈递给APC细胞的特殊信号。不能有效的激活人体内的抗原呈递细胞，从而造成体内肿瘤细胞的免疫逃逸。

人体内存在大量天然的anti-Gal抗体，该抗体可以与细胞膜表面的α-gal表位特异性的相互结合，并通过anti-Gal抗体上的Fc片段与APC细胞上的Fcγ受体结合来增强APC细胞对肿瘤细胞的识别和呈递作用。同时，这种天然存在的抗体也是补体介导的急性排斥反应和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用的基础。现有技术则是通过异源融合基因修饰来使肿瘤细胞表达α-gal表位。但过程复杂，效率不高，不可控因素多，且存在异源争议。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种α-gal表位修饰试剂盒，以解决现有技术通过异源融合基因修饰来使肿瘤细胞表达α-gal表位时，过程复杂，效率不高，不可控因素多，且存在异源争议等技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种α-gal表位修饰试剂盒，所述试剂盒的组分包括：MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)溶液，UDP-gal(尿嘧啶二磷酸半乳糖，Uridine diphosphate galactose)溶液，α1,3-GT(α-1，3半乳糖基转移酶)酶液，NA(神经氨酸酶)溶液，FITC-Lectin(荧光素标记抗凝集素抗体)溶液和生理盐水。

进一步地，所述MES溶液为包含等摩尔比的MuCl₂和MES的混合溶液，MuCl₂用于促进反应中的α1,3-GT酶的活性。

本发明还提供了上述α-gal表位修饰试剂盒在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

本发明的原理是，利用重组α1,3-半乳糖基转移酶在自体肿瘤细胞膜表面合成α-gal表位来制备自体肿瘤疫苗，利用重组α1,3-半乳糖苷转移酶在自体肿瘤细胞(膜)的糖蛋白和(或)糖脂的糖链末端合成α-gal表位，增强自体肿瘤疫苗的免疫原性，继而可能提高疫苗被APC细胞呈递的效率，强化APC细胞对肿瘤抗原的递呈作用，同时激活补体系统，活化机体的细胞免疫和体液免疫，起到对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤作用。

α-gal表位合成示意

N-acetyllactosaminyl -gal epitope

(LacNAc)

α-gal表位(Galα1-3Gal一β1-4GlcNAc—R)是广泛存在于非灵长类哺乳动物和新大陆猴细胞表面的糖蛋白和糖脂的末端结构，而人类和他们的近亲旧大陆猴、猿由于缺少编码α1,3-半乳糖苷转移酶的活性基因，没有该表位的生成。而在它们体内却存在一种能够与α-gal表位特异性结合的天然抗体anti-αGal，约占血清IgG的1％，这是肠道菌群长期刺激产生的结果。通过在肿瘤细胞膜表面构建α-gal表位，在体内anti-αGal就会与其结合形成抗原抗体复合物。

α-1,3半乳糖基转移酶是位于高尔基复合体上的一种糖基化酶，其可以催化尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDP-Gal)中的半乳糖基以α1,3键的形式转移到糖脂和(或)糖蛋白上的N一乙酞乳糖胺残基(N-Acetyllactosamine,Galβ1-4G1cNac-R)(简称LacNAc)上，在糖链的末端形成α-半乳糖表位(α-gal表位，Galα1-3Galβ1-4G1cNac-R)，同时生成游离的尿嘧啶二磷酸(UDP)。

本发明还提供了一种α-gal疫苗，所述α-gal疫苗是利用上述α-gal表位修饰试剂盒对肿瘤细胞进行标记制备获得的，具体包括以下步骤：

(1)将肿瘤细胞、MES、UDP-gal、α1,3-GT和NA混合于生理盐水中，置于37℃下反应3小时后，离心去除上清，获得反应细胞，孵育期间多次摇匀细胞，防止细胞沉淀；