[发明专利]一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种基于双抗体夹心法的电化学免疫检测方法，具体的说是一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法。

背景技术

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、己烷雌酚(hexestrol，HEX)和己二烯雌酚(dienestrol，DIEN)(结构见式1)属于人工合成的雌激素类物质(以下简称雌酚)，具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用，20世纪60年代曾广泛应用于畜牧业生产。这类人工激素可通过食物链干扰人体正常的激素平衡，危害人类健康，如导致机体代谢紊乱、发育异常、乳腺癌和胎儿畸形等严重的问题，在我国和欧美等国家都明令禁止在动物养殖过程中使用。

双酚A(bisphenol A，BPA)(结构见式1)从60年代以来就被广泛应用于制造塑料(奶)瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层，从矿泉水瓶、医疗器械到食品包装的内里，都有它的身影，可说是无处不在。双酚A的结构和性质与雌酚类似，能导致内分泌失调，此外癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与其有关。欧盟认为含双酚A的奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含双酚A的婴儿奶瓶。

目前用于雌酚和双酚A的检测的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，检测时间长、成本高，因此有必要建立更加高效、快速、灵敏的分析测试方法。

双抗体夹心法通常被用于大分子抗原(如蛋白质、病毒、肿瘤标志物等)的分析检测，而小分子化合物由于体积较小，通常无法同时结合两个抗体，因此小分子化合物一般难以用双抗体夹心法进行检测。雌酚及双酚A皆为具有对称结构的双官能团线型分子，从理论上讲可以和两个抗体同时结合，是本发明采用双抗体夹心法检测雌酚及双酚A的基础。

发明内容

本发明提供了一种基于双抗体夹心法的检测雌酚和双酚A的方法，所述的方法快速、高效、灵敏度高，具有很低的检测限(0.037～0.060ng/mL)和较宽的线性范围(0.5～1000ng/mL或0.5～500ng/mL)。

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

1)纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器的制备：先将纳米金颗粒通过电化学还原法沉积到处理好的玻碳电极表面，然后通过自组装法将巯基乙酸修饰到纳米金颗粒表面，最后采用活化羧基法将己烷雌酚单克隆抗体偶联到电极表面修饰的纳米金颗粒上，制得电化学免疫传感器；

2)标准溶液的配制：配制含有雌酚或双酚A的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的雌酚或双酚A的标准溶液作为空白标样；

3)工作曲线的建立：首先将步骤1)所述电化学免疫传感器浸入步骤2)所述标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其浸入含有0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体的溶液中进行孵育，之后以磷酸缓冲溶液冲洗，再将其在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；空白标样对应的响应电流记为I₀，含有雌酚或双酚A标样的响应电流记为I_x，响应电流的变化值ΔI等于I_x与I₀之差的绝对值；将所述ΔI与标准溶液中雌酚或双酚A浓度的对数值lgC绘制成ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程；

4)雌酚和双酚A的测定：配置含有待测样品的磷酸缓冲溶液，按照与步骤3)相同的方法对所述免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的变化值ΔI和ΔI-lgC线性回归方程，得到雌酚和双酚A的含量。

所述纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器采用以下方法制备：首先将清洁干净的玻碳电极浸入质量百分浓度为0.5％的氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸还原为纳米金颗粒从而沉积于玻碳电极表面；然后将玻碳电极置于1mmol/L的巯基乙酸水溶液中，通过自组装的方法在纳米金颗粒表面修饰巯基乙酸；再将玻碳电极置于含有0.1mol/L的N-溴代琥珀酰亚胺和0.1mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，活化羧基；在上述活化羧基后的玻碳电极表面滴涂质量浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体，4℃条件下反应，制得所述的纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器。