[发明专利]LRP5作为用于鉴定免疫细胞特别是B细胞的表观遗传标志物

说明书

本发明涉及用于鉴定B细胞的方法，特别是体外方法，其包括分析哺乳动物低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)的基因区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与非B细胞相比时，所述基因区的去甲基化或缺乏甲基化指示B细胞。本发明的分析可在表观遗传水平上鉴定B细胞，并在复杂样品(例如其他血液细胞或免疫细胞)中将其与所有其他细胞区分。此外，本发明提供了特别是在复杂样品中定量B细胞的改进的方法。可在没有纯化和/或富集细胞的步骤情况下，优选在全血和/或未经胰蛋白酶消化的组织中实施所述方法。还要求保护试剂盒以及用于鉴定甲基化的特异性引物和探针。

本发明涉及用于鉴定B细胞的方法，特别是体外方法，其包括分析哺乳动物低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)的基因区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与非B细胞相比时，所述基因区的去甲基化或缺乏甲基化指示B细胞。本发明的分析可在表观遗传水平上鉴定B细胞，并在复杂样品(例如其他血液细胞或免疫细胞)中将其与所有其他细胞区分。此外，本发明提供了特别是在复杂样品中定量B细胞的改进的方法。可在没有纯化和/或富集细胞的步骤情况下，优选在全血和/或未经胰蛋白酶消化的组织中实施所述方法。

此外，本发明涉及用于实施上述方法的试剂盒及其相应的用途。本发明一个目的是提供一种定量检测和测量哺乳动物的任何实体器官或组织或任何体液内的血液B细胞的新的、更稳健的手段。

发明背景

B细胞或B淋巴细胞是适应性免疫系统的体液免疫中的一种类型的淋巴细胞。通过B细胞外表面上被称为B细胞受体(BCR)的蛋白的存在，可将B细胞与其他淋巴细胞，如T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。这个专门的受体蛋白使得B细胞结合到特定抗原。在哺乳动物中，在骨髓中形成未成熟的B细胞。

B细胞的主要功能是产生响应于抗原的抗体，以进行抗原呈递细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用激活后发育成记忆B细胞。B细胞也释放细胞因子(蛋白)，其被用于免疫调节功能的信号转导。

尽管个体中几乎所有的细胞都含有完全相同的DNA编码的互补物，但是高等生物必须在不同类型的组织中施加并保持不同的基因表达模式。大多数基因调控是瞬时的，这取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持续性调控是表观遗传学的主要作用—不改变DNA的基本遗传编码的可遗传的调控模式。DNA甲基化是表观遗传调控的典型形式；它作为细胞的稳定记忆，在维持各种细胞类型的长期身份中发挥着至关重要的作用。最近发现了其他形式的表观遗传调控。除了“第五个碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)，可发现第六个(5-羟甲基胞嘧啶，hmC)、第七个(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八个(5-羧基胞嘧啶，cC)碱基(Michael J.Booth et al.Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18May 2012,Vol.336no.6083pp.934-937)。

所提到的DNA修饰的主要靶标是两个核苷酸的序列胞嘧啶鸟嘌呤(“CpG位点”)；在此情况下，胞嘧啶(C)可经简单的化学修饰以变成甲酰化的、甲基化的、羟甲基化的或羧化的。在人类基因组中，除了在被称为“CpG岛”的某些相对密集簇之外，CG序列比预期更罕见，。CpG岛通常与基因启动子相关，估计超过一半的人类基因具有CpG岛(Antequera andBird,Proc Natl Acad Sci USA 90:11995-9,1993)。