[发明专利]一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用，属于酶工程领域。本发明提供了一种碱性果胶酶突变体、表达该突变体的基因工程菌及应用该基因工程菌生产碱性果胶酶活性包涵体的方法。应用该方法制备的活性包涵体的酶活可达36.87±3.51U/mL，与对照相比提高了26倍。该碱性果胶酶活性包涵体易于分离及重复利用，性质稳定，在在60℃下保温50min后仍然具有70％以上的的酶活，具有重要的工业价值。

技术领域

本发明涉及一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。

目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种碱性果胶酶的突变体，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO,2所示。

本发明的第三个目的是提供获得所述碱性果胶酶突变体的方法，是将SEQ IDNO.3所示碱性果胶酶氨基酸序列中的自组装双亲短肽AEAEAKAKAEAEAKAK突变为AELEAKLKAELEAKLK。

在本发明的一种实施方式中，所述AELEAKLKAELEAKLK以PT-linker为连接肽与SEQID NO.3所示碱性果胶酶N端连接，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的碱性果胶酶突变体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主、pET-22b(+)为载体，表达所述碱性果胶酶突变体。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将编码所述碱性果胶酶突变体的基因与载体连接，表达至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-22b(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产碱性果胶酶包涵体的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至TB培养基中，30～37℃培养10～36h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至TB培养基中，37℃培养10～36h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以3～5％(v/v)的接种量进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以3％(v/v)的接种量进行接种于TB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至含有2％的葡萄糖的LB培养基中，37℃培养10～12h，再以3％v/v的接种量转接至TB培养基中。

在本发明的一种实施方式中，当菌体浓度OD₆₀₀＝0.55～0.65时加入终浓度0.04mMIPTG进行诱导，30℃下诱导培养24～72h。