[发明专利]一种全基因组高效基因区富集测序方法

说明书

本发明提供一种全基因组高效基因区富集测序方法，包括步骤：A）样品进行全基因组DNA的提取；B）全基因组mRNA的提取；C）全基因组mRNA反转录为cDNA；D）全基因组cDNA的碎片化；E）分批回收短序列片段；F）进行单酶切；G）酶切片段末端可增加barcode接头连接；H）DNA酶切片段装入环形质粒中，构建DNA文库；I）根据质粒两端序列分别设计两对引物为右引物；J）对H中构建好的DNA文库进行PCR扩增；K）扩增片段进行高通量测序，获得基因区富集序列。本发明对于真核生物的复杂基因组，通过本方法构建的文库，可以极大的降低测序成本，同时得到更有效的基因组基因区数据。

技术领域

本发明涉及基因组学、生物技术领域，及而言涉及将基因区富集测序、简化重测序、重复序列去除为目的，一种全新的巧妙利用基因组自身基因序列，进行基因区序列的富集测序方案，进而降低测序成本、减少信息处理量，提供特殊基因区文库。对后基因组时代与复杂基因组具有重要意义，应用将及其广泛。

背景技术

1基因富集的方法

1.1 cDNA文库(cDNA library)与转录组测序。1976年Hofstetter成功的构建了第一个cDNA文库以来,构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA文库的构建是分子生物学领域的一项重要技术。cDNA是以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，在体外被逆转录为cDNA第一链，再以cDNA为模板，由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ合成第二链，得到双链cDNA。由于组织或细胞的总RNA或mRNA中，含有该细胞的全部mRNA分子，因而被合成的cDNA 产物将是各种mRNA拷贝的群体。当它们与质粒重组后并转化至宿主细胞中，将得到一系列克隆群体，每个克隆仅含有一种mRNA信息，所有克隆的总和则包含细胞内全部mRNA的信息，这种克隆群体则为cDNA文库。目前,广泛使用的方法是SMART技术。目前对于大多数物种而言,全基因组测序是不现实的, 为了快速、经济地获得基因序列、了解基因的功能以及基因组中基因数量等相关信息,构建cDNA文库是一种有效、简便且快速的可行方法。所以cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。但是有了最新的测序技术，我们将不再需要构建克隆文库，可以直接对cDNA片段进行测序。对RNA 进行测序一直以来都被认为是一种发现基因的有效方法，而且这种方法还被认为是对编码基因以及非编码基因进行注释的金标准。与以前的方法相比，大规模平行RNA测序方法(massivelyparallel sequencing of RNA)极大增强了RNA测序技术的处理能力，使我们得以能够对转录组进行测序。我们现在可以只需要花费几天，仅用以往同类项目科研经费的很少一部分就能够得到一个比较满意的完整的细胞转录组。

1.2外显子捕获技术

外显子捕获测序和转录组测序都是针对基因组上转录区域进行测序，但是外显子捕获测序针对已有基因组信息的物种，而转录组分析既能针对已有基因组信息的物种，也能针对没有基因组信息的新物种，因此，两者的分析存在一定的差异：(1)分析的目标区域有所不同。外显子捕获测序只针对基因组上已知的编码区，而转录组测序不仅针对基因组上已知的编码区，还能够检测非编码RNA等转录组的信息。(2)分析的手段所有不同。外显子捕获测序只需要把测序结果比对基因组，分析序列差异。转录组测序既可以把测序结果比对基因组，也可以进行从头(de Novo)拼接。(3)得到的结果有所不同。外显子捕获测序可以得到序列变异的信息，而转录组测序不仅可以获得已知序列的变异信息和新的转录本信息(针对从头拼接)，还可以得到表达谱信息。除此以外，转录组测序还能够分析mRNA的可变剪接，而外显子捕获测序的样品来源是基因组，不能够进行 mRNA的可变剪接分析，只能够得到外显子上的序列变化。