[发明专利]肝素寡糖制备抑制细胞异常增殖药物的新用途

说明书

技术领域

本发明涉及肝素寡糖分子量为3200D，具有抑制细胞异常增殖导致的动脉粥样硬化斑块生成的作用，属于生物医药领域。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)已经成为人类死亡的重要原因，其中普遍认为血管平滑肌细胞的增殖在动粥斑块的形成中占了重要的作用，其主要在生长因子、炎症因子、ROS等刺激因素的作用下，产生增殖效果，进而产生一系列变化，形成动脉粥样硬化斑块。

肝素寡糖是由肝素经亚硝酸裂解后，经分离纯化得到的分子量为3200D左右的、成分为十二糖的寡糖链。已有实验表明此分子量的肝素寡糖对于血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)等促血管平滑肌细胞的增殖作用有抑制效果，同时也抑制了生长因子受体通路的激活。但是对于肝素寡糖抑制细胞增殖中作用靶点未作出明确研究。

发明内容

本发明的目的是提供肝素寡糖作为抑制细胞异常增殖药物的应用。

本发明采用不同浓度的肝素寡糖作用于人主动脉平滑肌细胞增殖模型，同时用VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂axinitib作为阳性对照组，发现生长因子VEGF同受体VEGFR2的结合受肝素寡糖浓度的影响，且VEGFR2的磷酸化受到了不同程度的抑制，尤其在肝素寡糖浓度为1μM浓度时，二者结合受抑制情况更为明显。此研究可为治疗细胞增殖导致的动脉粥样硬化斑块生成提供新的途径。

下面是药理学部分试验及结果：

一、建立实验细胞模型

取生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期人主动脉平滑肌细胞以8×10³细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板，固定24h后，将细胞分为空白组(0.5％胎牛血清DMEM培养基)、给药组(0.5％胎牛血清DMEM培养基及不同浓度的VEGF)。给药组分别为1，3，5，10，15，20，30ng/mlVEGF，细胞培养24h。

二、给药后主动脉平滑肌细胞进行cell-based ELISA检测

取生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期人主动脉平滑肌细胞以8×10³细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板，固定24h后，将细胞分为空白组(0.5％胎牛血清DMEM培养基)、模型组(0.5％胎牛血清及5ng/ml VEGF生长因子)、给药组(0.5％胎牛血清DMEM培养基、5ng/ml VEGF生长因子及不同浓度肝素寡糖)，肝素寡糖组分为0.01、0.1、1μM浓度组。细胞培养24h。

三、给药后人主动脉平滑肌细胞VEGF-VEGFR2进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)检测

取生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期人主动脉平滑肌细胞以1×10⁶细胞/孔的密度均匀接种于6孔培养板，固定24h后，将细胞分为空白组(0.5％胎牛血清DMEM培养基)、模型组(0.5％胎牛血清及5ng/ml VEGF生长因子)、给药组(0.5％胎牛血清DMEM培养基、5ng/ml VEGF生长因子及不同浓度肝素寡糖)，肝素寡糖组分为0.01、0.1、1μM浓度组。细胞培养24h。之后对细胞进行Co-IP检测。

附图说明

图1是MTT法确定VEGF诱导VSMCs细胞增殖最佳浓度。

图2是MTT法确定Axinitib抑制VSMCs细胞增殖最佳浓度。

图3是VSMCs细胞在5ng/ml的VEGF作用造模后加不同浓度肝素寡糖(0.01，0.1，1μM)的cell-based ELISA结果

图4是VSMCs细胞在5ng/ml VEGF及不同浓度肝素寡糖和10nM Axinitib作用下细胞CO-IP的VEGF及VEGFR2结果，及细胞内参β-actin的WESTERN BLOTTING结果图。

图5是VEGF及VEGFR2的灰度分析。

图6是体外肝素寡糖对肝素的竞争性结合实验。

具体实施方式

1)MTT法给药24h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4h。吸出培养液后每孔加入DMSO 150μL溶解结晶，振荡混匀后于570nm处测定各孔吸收度。

2)cell-based ELISA检测