[发明专利]一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构建方法

权利要求书

1.一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母为将 α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因通过产朊假丝酵母多基因共表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成；

α-淀粉酶和糖化酶为表面展示表达；酸性蛋白酶为分泌表达；

所述产朊假丝酵母多基因共表达载体为以酿酒酵母多基因共表达载体为基础，去除酿酒酵母多基因共表达载体的 rDNA 序列，以产朊假丝酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子替换酿酒酵母多基因共表达载体的酿酒酵母磷酸甘油酸激酶启动子而得；

所述产朊假丝酵母构建方法具体如下：

S1：使用限制性内切酶对产朊假丝酵母多基因共表达载体、酿酒酵母多基因共表达载体，以及 SEQ ID NO.1 所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.2 所示的糖化酶基因和 SEQ IDNO.3 所示的酸性蛋白酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用 DNA 连接酶将 α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连接入酿酒酵母多基因共表达载体，将酸性蛋白酶基因连入产朊假丝酵母多基因共表达载体， 形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的 α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有酸性蛋白酶基因的单基因表达载体中，构建出 α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入产朊假丝酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。

2.根据权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤 S3 中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶对 α-淀粉酶和糖化酶重组单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶对酸性蛋白酶重组单基因表达载体进行酶切，然后将糖化酶基因表达盒连入酸性蛋白酶单基因表达载体，构建糖化酶和酸性蛋白酶二基因表达载体；

S13：使用限制性内切酶对步骤 S12 所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出 α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体。

3.根据权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤 S1 中所述的限制性内切酶为BamHI和SpeI；步骤S4中所述的限制性内切酶为SacI。

4.根据权利要求2所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤 S11 中所述的限制性内切酶为 NheI 和XbaI；所述步骤 S12 中所述限制性内切酶为 NheI；所述步骤 S13 中所述限制性内切酶为 NheI。

5.一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母，其特征在于，采用权利要求1 至 4 任一项所述方法制备。