[发明专利]检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法

说明书

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法，属于生物传感器技术领域。识别元件是单链DNA适配体，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝作为信标分子。适配体通过Au‑S键固定在金电极表面，亚甲基蓝作为电化学响应信号，孔雀石绿与适配体相互作用改变适配体的空间构型，使电化学信号升高，从而实现对孔雀石绿的快速检测。优点在于，适配体价格经济、易于标记，传感器的制备程序和检测方法简单，可应用于水体中现场准确、快速和高灵敏地检测孔雀石绿。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法。可以用于渔业生产中孔雀石绿的检测。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green,简称MG)，属三苯甲烷类染料，其代谢为无色孔雀石绿，长期以来，由于孔雀石绿在水产养殖中具有良好的抗真菌病，水产品保鲜以及价格低廉等优点，因此，成为许多养殖户青睐的“渔药”来使用，但这两种物质均具有高毒素、高残留和高致畸、致突变等副作用，已成为重大的食品安全隐患。目前，孔雀石绿被我国列为禁用渔药，现有的测定方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等。这些方法有操作繁琐、仪器价格昂贵，需要专业的技术人员，而且不适合现场大规模的检测等缺点。而现场常使用商品化酶联免疫试剂盒法检测孔雀石绿，但容易产生假阳性结果。因此，我国急需建立一种准确、快速、便携、简单操作的检测孔雀石绿的方法

近年来，适配体(aptamer)作为识别元件特异性识别小分子的生物传感器成为研究热点，主要是其识别元件较稳定，受环境干扰和限制比较少，易于合成等方面的优势。目前，已有两个专利公开了两种适配体型检测孔雀石绿的方法。其中，公开专利(申请号为200710070381.0)一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，利用特定序列的单链DNA为适配体，采用酶联显色法检测，但其酶联法易产生结果假阳性的问题没有解决。另一个，公开专利(申请号为201410008020.3)一种通过电化学适配体传感器来检测孔雀石绿的方法，采用特定序列RNA为识别元件，通过适配体和目标物的结合作用把目标物结合到电极表面，然后在结合上目标物的抗体，构成夹心结构；电化学方法避免了一定程度在检测中的假阳性问题，但是该专利中抗体制备需要动物性实验时间长，也比较困难；更主要的RNA适配体价格昂贵、不稳定而且标记相当困难，这也限制了RNA适配体在检测孔雀石绿方面的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器及其制备方法，解决了检测结果易出现假阳性的问题，并大幅降低了成本。针对现有的技术的不足，提供一种快速、简单、准确、成本低可用于水溶液中孔雀石绿检测的适配体型电化学生物传感器及其制备方法。

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件和换能器；识别元件是单链DNA适配体，序列为GGATCCCGACTGGCGAGAGCCAGGTAACGAATGGATCC，含有38个碱基，5’端修饰‐SH‐(CH₂)₆‐，在3’端修饰电活性物质亚甲基蓝(MB)作为信标分子；换能器为常用的电化学型换能器，工作电极为修饰有上述孔雀石绿单链DNA适配体的金电极，对电极为Pt，参比电极为Ag/AgCl；检测底液为磷酸盐缓冲溶液。

其检测原理是：加入孔雀石绿靶分子之前信标分子MB距离电极表面较远，电子转移较慢，MB电化学信号响应较小，加入孔雀石绿后与单链DNA适配体相互作用形成茎环，MB与电极表面之间的距离被拉近，其电化学信号增加，通过电化学信号的变化，实现对孔雀石绿的检测。

图1给出单链DNA适配体和孔雀石绿相互作用的紫外‐可见光谱图。从图1中可以看出，在波长范围为220～320nm区间，单链DNA适配体本身在260nm处有一个吸收峰。当加入孔雀石绿靶分子后，该吸收峰降低，说明两种存在着相互作用。

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器的制备方法，具体步骤及参数如下：