[发明专利]一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，与现有技术相比，本发明利用静电纺丝技术，使用生物相容性好且具有特殊保水性的透明质酸改性纳米纤维，并将此功能性纳米纤维应用于酶的固定，操作相对简便，而且混纺PMA‑AA@透明质酸纳米纤维形态稳定、孔隙率高、比表面积大，并含有大量的羧基。可应用于酶固定领域，显著提高酶的固载量和活性，具有显著的功能性。

技术领域

本发明属于功能性纤维领域，具体涉及一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法。

背景技术

利用含有功能性基团的高聚物为基体，通过混纺技术，合成具有特定表面性质的功能性高分子材料用以固定脂肪酶一直是酶固定领域的研究重点。表面富含羧基的PMA-AA纳米纤维虽然具有较大的比表面积，但该基体在接枝反应过程中，形态结构不稳定，甚至于完全失去纳米纤维形态，此外该纳米纤维呈现疏水性能。

静电纺丝技术制备纳米纤维，当前此类酶固定载体一方面以普通聚合物为基体，此类基体生物相容性差，难以为酶提供温和的微环境。另一方面以吸附或者共价键的方式接枝壳聚糖等生物相容性材料对纳米纤维表面进行改性；此类方法步骤繁琐，由于较大的空间位阻，接枝率低；物理吸附的改性材料容易脱落。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，以PMA-AA纳米纤维为基体，通过静电纺丝技术混纺透明质酸钠。对混纺后得到的纤维进行酸化，得到混纺有透明质酸的纳米纤维，形态稳定，孔隙率高，比表面积大，表面含有大量的羧基。将其作为脂肪酶的固定化载体进行固定化酶，形态稳定，有较高的稳定性和活性。

本发明提供的一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，包括以下步骤：

1)将PMA-PAA溶液与透明质酸钠溶液混合，震荡混匀后，即得到纺丝前驱体溶液；

2)取纺丝前驱体溶液，采用静电纺丝技术进行纺丝，得到纳米纤维膜；

3)室温下，将纳米纤维膜冲洗后，浸泡于盐酸溶液中，再冲洗去除表面盐酸，吹干后置于EDC/NHS溶液中反应活化，再冲洗，吹干后置于酶溶液中，震荡反应后，即得透明质酸混纺纳米纤维固定酶。

进一步的，步骤1)中，所述PMA-PAA溶液的制备方法为：

将2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二异丙腈，充氮气10～12min后，放到60～80℃恒温水浴锅加热，反应15～24小时，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。

步骤1)中，所述透明质酸钠溶液的制备方法为：

将DMF溶液和蒸馏水混合后，将透明质酸钠固体加入其中，溶解得到透明质酸钠溶液；其中，DMF溶液、蒸馏水和透明质酸钠固体的用量比为：3ml:3ml：8～48mg。

步骤(1)中透明质酸钠溶液与PMA-PAA溶液的体积比为(0.5-3):5。

步骤2)中所述静电纺丝技术进行纺丝具体为：纺丝在室温条件下进行，湿度30％～40％，溶液注射速度为0.3～0.5mL/h，电压为16～18kV，喷丝口与接收屏距离为12～18cm，针头直径为5.5mm针头接入正极，铝箔接入负极。纺丝液在电场中产生稳定细流，细流经过分裂与拉伸，最终收集到接收铝箔上，接收时间24～26小时。所纺出纤维直径在200-500nm。

步骤3)中所述盐酸溶液浓度为0.01mol/L；纳米纤维膜与盐酸溶液的体积比为：1:5g/mL；浸泡时间为1h；

步骤3)中所述EDC/NHS溶液中EDC和NHS的摩尔比为1:2；优选的，EDC和浓度0.1M，NHS的浓度0.2M。

步骤3)中纳米纤维膜在EDC/NHS溶液中活化时间为0.6-1.5h；