[发明专利]心肌肌钙蛋白I/N‑端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定试剂盒及制法

权利要求书

1.一种心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球分别标记的抗心肌肌钙蛋白I、抗N-端脑利钠肽前体、抗D二聚体三种单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550-650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别均来源于针对2-6个不同的心肌肌钙蛋白I、N-端脑利钠肽前体、D二聚体等抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径是120-200nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素Eu³⁺。

3.根据权利要求2所述的一种心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球含稀土镧系元素Eu³⁺；结合垫上稀土荧光微球标记的三种抗体均来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I、N-端脑利钠肽前体和D二聚体三种偶联复合物混匀后喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干1小时后制得。

5.根据权利要求4所述的一种心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I/N-端脑利钠肽前体/D二聚体三合一测定剂盒中的三种单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：分别用心肌肌钙蛋白I、N-端脑利钠肽前体、D二聚体纯品分别免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的单抗细胞株；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗心肌肌钙蛋白I抗体、抗N-端脑利钠肽前体抗体和抗D二聚体抗体等三种鼠源单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土Eu³⁺荧光微球的醛基化：取5mg稀土荧光微球，用20mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土Eu³⁺荧光微球标记的抗心肌肌钙蛋白I抗体、抗N-端脑利钠肽前体抗体和抗D-二聚体抗体等三种偶联复合物的制备：三种抗体-微球偶联复合物分别单独偶联，操作如下：选取来自2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，按照质量比1:1将2mg心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的50mM Tris-HCL缓冲液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存备用。同样操作分别制备抗N-端脑利钠肽前体抗体-微球偶联复合物和抗D-二聚体抗体-微球偶联复合物，4℃避光保存备用。