[发明专利]可视化MTHFR等位基因分型检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种MTHFR等位基因(rs1801133和rs1801131)分型检测试剂盒。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，维持叶酸正常代谢。MTHFR等位基因位点rs1801133和rs1801131(c.677和c.1298位点)突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。对于MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，造成叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。

另外，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)还参与同型半胱氨酸代谢过程，维持体内正常的同型半胱氨酸水平。研究发现，MTHFR基因c.677位点发生突变，会导致MTHFR的不稳定，致使酶活力的下降，最终致使血浆同型半胱氨酸水平的升高。同型半胱氨酸血症有引起动脉粥样硬化和血栓形成的危险，并最终可引起冠心病、脑梗死和外周血管病。中国人群中MTHFR C677T突变率高达25％，是中国H型高血压与脑卒中高发的重要遗传因素，因此，检测MTHFR基因c.677位点还具有预测携带者患高血压、脑卒中等疾病的作用。

目前市场上已有的MTHFR等位基因分型检测试剂盒基本都是基于荧光信号检测的PCR扩增技术，需要用到实时荧光PCR设备，其价格较为昂贵，不利于在设施条件差的医疗单位使用。而同时临床中，至今为止尚未有能够直接采用普通PCR循环仪器就能够实现可视化分型MTHFR等位基因的闭管方法。

发明内容

基于此，本发明的目的为提供一种对设施条件要求低、结果判读简单、成本低廉的新型MTHFR等位基因分型检测试剂盒,可实现分别针对MTHFR等位基因SNP位点位点1(rs1801133)野生型(P1)、位点1(rs1801133)突变型(P2)、位点2(rs1801131)野生型(P3)和位点2(rs1801131)突变型(P4)的分型检测。

实现上述目的的技术方案如下。

一种可视化MTHFR等位基因分型检测试剂盒，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；

所述4条引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；

所述2条与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。

本发明利用了基于纳米金探针的可视化核酸检测技术，在将高灵敏的PCR扩增方法、高特异的酶切方法及可视化的纳米金探针检测方法相结合，用于MTHFR等位基因分型的可视化检测，实现低成本、高灵敏的MTHFR等位基因分型检测。通过检测携带者基因组DNA中的SNP位点(rs1801133和rs1801131)单核苷酸多态性位点，判定该携带者的MTHFR等位基因类型，并根据携带者的等位基因类型指导携带者服用叶酸剂量，或提醒携带者患高血压、脑卒中等疾病的风险，从而起到预警作用，提高携带者的生活质量，为临床和患者提供一种新型检测方法。

本发明具有以下有益效果:

采用本发明中的试剂盒对MTHFR等位基因SNP位点进行分型检测无需使用荧光探针，试剂存放无需避光，不必担心荧光衰减的问题，因此存放条件更加稳定。

本发明采用的纳米金探针有比较成熟的方法合成，成本低；具备高稳定性，能够耐受强热循环和强机械冲击；具备强适用性，能够与各种酶反应液共存而不影响反应的正常进行。

利用本发明中的试剂盒可实现短时间高灵敏度的闭管核酸检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。

本发明中的试剂盒能够采用普通PCR仪完成对MTHFR等位基因位点的分型检测，且结果区分特征明显。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1是本发明中引物探针设计原理。

图2是实施例2中检测反应的灵敏度。

图3是实施例3中匹配基因型检测结果。

图4是实施例4中干扰实验检测结果。

图5是实施例5中代表性样本检测结果。