[发明专利]一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株高产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌是将谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum H5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。本发明还公开了该基因工程菌的构建方法及应用，本发明提供的基因工程菌用于发酵生产L‑异亮氨酸，可提高产量和糖酸转化率。

技术领域

本发明涉及一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，其构建方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

L-异亮氨酸，又称L-异白氨酸，化学名为L-α-氨基-β-甲基戊酸，属于天冬氨酸族非极性、输水性氨基酸的一种。L-异亮氨酸作为人体必需的8种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值。

由于L-异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以用化学合成方法生产比较困难，成本很高。生物转化法制造L-异亮氨酸是将α氨基丁酸和α-氧代丁酸等作为前体原料进行生物合成，但由于原料昂贵，同样存在生产成本过高的问题。因此，通过微生物发酵来生产L-异亮氨酸是一种必然的发展趋势。

CN 105176907 A公布了一株通过重组大肠杆菌构建的L-异亮氨酸基因工程菌，通过大肠杆菌发酵生产L-异亮氨酸，最终产量为16.05±0.16g/L，糖酸转化率达40.78％。

CN 104480057 A构建了alr基因缺陷的谷氨酸棒杆菌宿主菌，再将fusA、frr、ilvBN、ilvA、ppnk等基因连接到过表达载体，然后电转入alr缺陷的宿主菌中，获得一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌，通过发酵产L-异亮氨酸，产量达到28.6g/L。

CN 105886431 A公布了一株诱变筛选得到的谷氨酸棒杆菌菌株，通过发酵产L-异亮氨酸，产量为28g/L。

CN 104212756 A公布了一株过表达fusA基因的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，摇瓶发酵产L-异亮氨酸为8.7g/L。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建和应用。本发明根据筛选得到的谷氨酸棒杆菌突变菌株Corynebacterium glutamicum H5的代谢特点，利用基因工程技术来改造其基因组，通过敲除或者插入相关基因，减弱代谢支路的杂酸如丙氨酸、缬氨酸等的合成；增加L-异亮氨酸的前体如天冬氨酸及苏氨酸的合成，促进碳通量更多流向L-异亮氨酸合成途径，使其在发酵过程中能大幅提高产L-异亮氨酸的能力，从而降低生产成本，具有广阔的工业应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，命名为C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子。

其构建方法包括以下步骤：

(1)出发菌株是本实验室筛选得到的突变菌株，命名为Corynebacteriumglutamicum H5，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，属于革兰氏阳性菌。