[发明专利]荧光RT-RCR检测河川沙塘鳢MyD88基因表达的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种荧光RT‑RCR检测河川沙塘鳢MyD88基因表达的试剂盒及其应用。本发明中河川沙塘鳢MyD88基因实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，为研究MyD88基因在河川沙塘鳢免疫体系中的进化地位及与疾病抗性的相关性，为进一步研究它们的生物学活性、功能和表达调控以及揭示河川沙塘鳢免疫抗感染机制奠定理论基础。MyD88介导了绝大多数TLR信号传导，在固有免疫反应中起着重要作用，MyD88基因的表达丰度在一定程度上反应了河川沙塘鳢的免疫系统活度，作为河川沙塘鳢疾病防治中的重要检测指标，可以在鱼体表现出疾病特征之前判断鱼体是否染病，以便提前采取有效的预防措施，防止出现因病害造成重大的经济损失。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种荧光RT-RCR检测河川沙塘鳢MyD88基因表达的试剂盒及其应用。

背景技术

鱼类通过特异性免疫和非特异性免疫系统来抵御外来病原生物的侵害，机体的先天性免疫依赖有限的模式识别受体去识别病原体相关分子模式。目前被鉴定的模式识别受体主要有两大类：胞质型模式识别受体(Cytosolic PRRs)和膜结合Toll样受体(Membrane-bound Toll-like receptors,TLRs)。

Toll样受体是研究最多的模式识别受体，其中MyD88介导了绝大多数TLR信号传导(除TLR3外)，是最为重要的接头分子之一，在先天免疫反应中起着重要作用。目前关于MyD88的研究主要集中在哺乳动物，关于鱼类的研究结果较少，仅在斑马鱼、牙鲆、虹鳟、斜带石斑鱼、大西洋鲑、大黄鱼等中有报道。

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术具有灵敏度高、特异性高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。

河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为我国特有的小型淡水底栖肉食性经济鱼类，在我国广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系。该鱼为淡水底栖小型肉食性鱼类，肉质细嫩，2011年作为上海世博会国宴招待贵宾用鱼，号称“世博第一鱼”，近年来已越来越受到人们的喜爱，2012-2015年市场价已达到160元/公斤以上，具有较高开发价值，但是人工养殖时易发生细菌性、真菌性病害，导致严重的经济损失。目前对河川沙塘鳢的研究主要集中在选育种和养殖等方面，对其免疫相关基因和抗病因子研究未见报道。因此，开展河川沙塘鳢的免疫相关基因(因子)研究，初步了解其免疫应答机制，对河川沙塘鳢病害防治和开辟河川沙塘鳢抗病育种新途径具有重要意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种荧光RT-RCR检测河川沙塘鳢MyD88基因表达的试剂盒及其应用，为研究MyD88基因在河川沙塘鳢免疫体系中的进化地位及与疾病抗性的相关性，为进一步研究它们的生物学活性、功能和表达调控以及揭示河川沙塘鳢免疫抗感染机制奠定理论基础。

技术方案：一种荧光RT-RCR检测河川沙塘鳢MyD88基因表达的试剂盒，包括MyD88基因特异引物对、内参基因β-actin引物对和PCR反应试剂，其中，

MyD88基因特异性引物对序列为：

MyD88-F：5’-TCCAAGGGTATCCCAACCCTC-3’(SEQIDNO.1)

MyD88-R：5’-CGTGGAGGACCTTCGTGCTT-3’(SEQIDNO.2)

内参基因β-actin引物对序列为：：

β-actinF：5’-TGGACTTCGAGCAGGAGATGAG-3’(SEQIDNO.3)