[发明专利]一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用

说明书

一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明可提升原有土著优势菌种的PAHs降解能力，解决外源PAHs降解菌在雨水花园土壤中无法形成优势种群而难以发挥降解作用的问题。

技术领域

本发明涉及一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

背景技术

近年来，由雨水径流导致的城市面源污染受到越发广泛的关注。为了降低径流中污染物对城市水体的危害，国内外普遍采用建设雨水花园的方式对雨水径流进行收集与净化。但长期运行过程中，某些难降解污染物会在雨水花园内部出现富集现象，加重其内部及周边区域的生态风险。在这类污染物中，多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)因为具有强烈的致畸、致癌、致突变效应，更受到了重点关注。

目前，未见针对雨水花园土壤中PAHs污染修复的系统研究，而传统修复方法普遍通过接种分离自异位原油污染场地得外源PAHs降解菌开展。这些菌株虽然有着良好的PAHs降解能力，但能否在理化性质及污染特征均有较大差异的雨水花园土壤中形成优势并发挥作用有待验证。在原油污染的土壤中，PAHs的浓度会达到较高的水平，足以通过生物抑制作用保证有降解能力的生物形成生长优势。而雨水花园中累积的PAHs浓度要比原油污染土壤低3-5个数量级，由于大量可同化有机物的存在，直接影响到PAHs特异性降解生物对于PAHs的优先利用；同时PAHs对其他微生物的抑制作用减小，使得特异性降解生物难以形成生长优势，从而降低了生物修复作用效率。

发明内容

本发明目的在于针对现有雨水花园中PAHs生物修复技术的不足，提供一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

一种多环芳烃降解基因工程菌株，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种构建所述的多环芳烃降解基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)土著优势菌株的筛选与培养

采集接纳道路雨水径流的实地雨水花园土壤，提取总DNA进行高通量测序，分析微生物群落，辨识优势菌属；同时筛选、培养得到土壤样品中菌落丰度较高的纯种菌株，并通过形态学观察、理化特性研究、抗生素抗性试验及16S rRNA序列同源性分析进行鉴定并确立其系统发育地位；对比群落分析辨识出的优势菌属，挑选出对应的纯种菌株作为雨水花园的土著优势菌株；

2)重组质粒pUT-RHDGfp的构建

分别以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因组DNA及pGFPuv(购自Clontech公司，日本)质粒为模板，扩增环羟化双加氧酶编码基因序列基因RHD与荧光蛋白编码基因Gfp；随后采用重叠PCR的方式将RHD基因与荧光蛋白编码基因Gfp进行融合，得到RHDGfp基因；切胶回收后PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)；连接酶切产物，得到重组质粒pUT-RHDGfp；

3)基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建