[发明专利]一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学领域和基因工程技术领域，具体公开了一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用。本发明利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ‑PGRP，仿刺参肽聚糖识别蛋白(AJ‑PGRP)为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。该重组蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有凝集作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域和基因工程技术领域，具体涉及一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

仿刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺参科(Stichopodidae)，主要分布在北纬35°～44°的西北太平洋沿岸，山东、辽宁和河北是我国仿刺参的主要养殖区。仿刺参位列“海八珍”之首，具有很高的营养价值和医药价值。近年来，随着人们社会生活条件的提高和健康意识的增强，仿刺参市场需求量逐年增加，不断刺激养殖规模加大，仿刺参因此成为我国水产养殖业中单一产值最大的养殖品种。但是养殖过程中遇到的病害问题一直是困扰产业进一步发展的重要制约因素。利用生物技术的手段进行疾病防治越来越引起人们的重视。

肽聚糖(Peptidoglycan)是存在于革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁中的一种复合糖类。主链是β-1,4-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的杂多糖。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，尤其在革兰氏阳性细菌中，其所含的肽聚糖占细胞壁干重的50～80％。

肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)是识别和结合肽聚糖的模式识别分子。通过识别入侵菌原菌的肽聚糖，进而激活Toll信号通路(Toll-likereceptors)途径和免疫缺陷(Immune Deficiency,IMD)途径等免疫信号通路并介导吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的过程中发挥着重要的作用。

1996年，Yoshida H首次在家蚕血淋巴中发现肽聚糖识别蛋白，随后在鱼类、软件动物和一些脊椎动物中也相继被发现。根据它们的序列结构特点，肽聚糖识别蛋白可以分为两个亚型，即长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖识别蛋白(PGRP-S)。而目前对于仿刺参肽聚糖识别蛋白尚未有报道。发掘仿刺参的功能基因，制备生物抗菌药物，有助于解决当前养殖中抗生素抗药性问题，因此具有十分重要的理论和现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请提供一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白的制备及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白，仿刺参肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)的制备方法为：

(1)以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，待用；

(2)PCR产物经纯化后与载体pEASY-E1载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子；

(3)将上述表达载体pEASY-AJ-PGRP转入Trans BL21(DE3)化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即得到序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP。

所述引物分别为：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTATAATTTCTTG-3’。