[发明专利]一种用于筛选弱MdmX抑制剂或测试弱MdmX抑制剂的抑制活性的融合蛋白

说明书

本发明公开了一种用于筛选弱MdmX抑制剂或测试弱MdmX抑制剂的抑制活性的融合蛋白，其中：测试序列为MdmX序列或其同源序列；结合序列为p53序列中的MdmX结合结构域的p53片段的突变体；连接臂序列为一个肽段，其上下游分别与测试序列和结合序列之一连接。结合结构域与测试结构域是否相结合的两种状态下融合蛋白中色氨酸发射光谱不同，且p53片段的突变体相对于野生型p53片段减弱了p53结合结构域与MdmX结合结构域的相互作用使较弱结合力的MdmX抑制剂得以与结合序列竞争性结合测试序列，可以由此有效地测定弱MdmX抑制剂对MdmX的抑制程度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于筛选MdmX抑制剂或测试Mdmx抑制剂的抑制活性的重组蛋白的制备和应用，特别是种用于筛选弱MdmX抑制剂或测试弱Mdmx抑制剂的抑制活性的重组蛋白的制备和应用，更具体涉及一种p53多肽和MdmX氨基端融合蛋白及其类似物的制备及其在筛选MdmX抑制剂或测试MdmX抑制剂的抑制活性中的应用。

背景技术

p53是一种抑癌蛋白，在细胞周期阻滞、DNA损伤修复及细胞凋亡等生物过程中发挥作用，并已成为重要的肿瘤治疗靶点。p53的抑制癌变活性受到细胞内过表达MdmX和Mdm2的抑制，与过半数的癌症相关。解除MdmX和Mdm2对p53的抑制是开发新型癌症治疗药物的靶点。

MdmX和Mdm2是p53下游的重要调控基因蛋白，MdmX和Mdm2为同源蛋白，两者结构高度相似，但抑制p53的机理有所不同。目前Mdm2抑制剂的筛选和设计较为成熟，许多已经进入临床研究阶段，例如nutlin-3a改进型分子RG7112即将进入II期临床研究(Ray-CoquardI,Blay J Y,Italiano A,et al.Effect of the MDM2antagonist RG7112 on the P53pathway in patients with MDM2-amplified,well-differentiated ordedifferentiated liposarcoma:an exploratory proof-of-mechanism study[J].Thelancet oncology,2012,13(11):1133-1140)。但是，MdmX抑制剂的有效筛选和设计进展缓慢。由于Mdm2抑制剂的抗药性问题(Lane D P,Cheok C F,Lain S.p53-based cancertherapy[J].Cold Spring Harbor perspectives in biology,2010,2(9):a001222.)，癌细胞中的MdmX会进一步过表达，加剧癌细胞的恶化。因此，寻找MdmX抑制剂，及以MdmX为基础而设计的MdmX/Mdm2双抑制剂是治疗近半数癌症的有效药物。

MdmX的N末端存在p53的结合域，MdmX的p53结合域可以和p53蛋白的转录激活结构域结合，形成p53/MdmX复合体，该复合体能够抑制p53的转录活性，但并不介导p53的降解，使p53蛋白失活而诱发肿瘤。

如若一种化合物，能和p53-MdmX复合物竞争性结合，释放p53的转录活性，或以竞争性或不可逆性结合游离的MdmX，则这种化合物可以解除或部分解除MdmX对p53的抑制，使得p53发挥抑癌的作用，因此，这种化合物可视为癌症的治疗或缓解用的药物。

现有技术中公开了一些通过与p53竞争性结合MdmX而测试MdmX抑制剂的技术方案。

中国专利文献CN105936646(公开日：2016.09.14)公开了一类迷你蛋白及其应用。所述迷你蛋白以白蛋白结合域的3α螺旋束为骨架蛋白，并且在所述骨架蛋白的三维结构表面、N端、C端中的至少一处引入有阳离子性氨基酸，并经所述阳离子性氨基酸至少连接p53与MDM2/MDMX结合的关键氨基酸位点。该迷你蛋白兼具入胞以及与白蛋白、MDM2/MDMX结合的能力，并可良好抑制p53和Mdm2/MdmX之间的相互作用，可用于制备抗癌药物等，可用于规模化生产和应用。小蛋白与Mdm2/MdmX的结合用的荧光偏振检测。