[发明专利]一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法

说明书

本发明公开了一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法。本发明通过热处理灭活汉逊德巴利酵母原生质体，紫外线灭活莫格球拟酵母原生质体；将灭活后的汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体进行电融合，然后进行培养，得到融合子，将融合子接种于含26％(w/w)NaCl的培养基培养发酵，检测发酵得到的产物的酯含量；同时检测融合子的生长速度，得到耐高盐高产酯酵母融合子。本发明提供的方法是原生质体电融合酵母选育方法，无细胞壁障碍，细胞融合频率高，从而使基因重组的频率也高，得到的融合子具有亲本的优点，耐高盐、高产酯以及耐高温。

技术领域

本发明涉及酵母菌育种领域，特别涉及一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法。

背景技术

酱油或酱的传统酿造生产中，存在多种耐盐性酵母，它们在发酵过程中所起的作用意义重大。其中，莫格球拟酵母能赋予酱油、酱特定香气成分，在食盐18％，含氮量1.4％左右的环境中繁殖，称之为“抗渗透压性酵母”或“耐盐性酵母”。但是，莫格球拟酵母在高盐条件下，生长缓慢，产酯香的能力较低，满足不了高品质酱油制备的需要。因此，亟需一种在高盐条件下，生长较快，产酯能力较强的菌株。这有利于提高酱油的酯香味，缩短发酵时间，节约生产成本。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的耐高盐高产酯酵母融合子。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，包括如下步骤：

(1)活化菌种：对汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母活化；

(2)制备原生质体：将活化后的汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母的细胞壁去除，分别得到汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体；

(3)灭活原生质体：

①通过热处理灭活汉逊德巴利酵母原生质体，使其灭活效率达到100％；

②通过紫外线灭活莫格球拟酵母原生质体，使其灭活效率达到100％；

(4)电融合灭活原生质体：将灭活后的汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体进行电融合，然后进行培养，得到融合子；

(5)筛选融合子：将融合子接种于含26％(w/w)NaCl的培养基培养发酵，检测发酵得到的产物的酯含量；同时检测融合子的生长速度，得到耐高盐高产酯酵母融合子。

所述的汉逊德巴利酵母优选为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)ZXL20141126，保藏编号GDMCC NO：60127，于2016年12月5日保藏于位于中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的莫格球拟酵母优选为莫格球拟酵母(Torulopsis mogii)ZXL20161207，保藏编号为GDMCC NO：60126，于2016年12月5日保藏于位于中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

步骤(1)中所述的活化的目的是使得汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母处于良好的生长状态，如处于对数生长期。所述的活化的步骤优选如下：取新鲜汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母的斜面菌种各一环，分别接种至麦芽汁液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养12h；再以1％(v/v)接种量分别转接菌液至麦芽汁液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养，其中汉逊德巴利酵母培养6h，莫格球拟酵母培养8h。

步骤(2)中所述的原生质体优选通过如下步骤制备得到：