[发明专利]一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法

权利要求书

1.一种耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)活化菌种：对汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母活化；

(2)制备原生质体：将活化后的汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母的细胞壁去除，分别得到汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体；

(3)灭活原生质体：

①通过热处理灭活汉逊德巴利酵母原生质体，使其灭活效率达到100％；

②通过紫外线灭活莫格球拟酵母原生质体，使其灭活效率达到100％；

(4)电融合灭活原生质体：将灭活后的汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体进行电融合，然后进行培养，得到融合子；

(5)筛选融合子：将融合子接种于含26％(w/w)NaCl的培养基培养发酵，检测发酵得到的产物的酯含量；同时检测融合子的生长速度，得到耐高盐高产酯酵母融合子；

所述的汉逊德巴利酵母为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)ZXL20141126，保藏编号GDMCC NO：60127，于2016年12月5日保藏于位于中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心；

所述的莫格球拟酵母为莫格球拟酵母(Torulopsis mogii)ZXL20161207，保藏编号为GDMCC NO：60126，于2016年12月5日保藏于位于中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

2.根据权利要求1所述的耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的活化步骤如下：取新鲜汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母的斜面菌种各一环，分别接种至麦芽汁液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养12h；再以1％(v/v)接种量分别转接菌液至麦芽汁液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养，其中汉逊德巴利酵母培养6h，莫格球拟酵母培养8h。

3.根据权利要求1所述的耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的原生质体通过如下步骤制备得到：

(A)将活化后的汉逊德巴利酵母和莫格球拟酵母的菌悬液浓度分别调整为10⁷个细胞/mL；分别取1mL，通过离心得到菌体；

(B)用高渗缓冲液洗涤菌体，离心，取菌体；在菌体中加入3mL预处理剂，于30℃、200r/min振荡处理20min；预处理剂的成分如下：PBS缓冲液为溶剂，含0.2％(w/w)β-巯基乙醇和0.1％(w/w)EDTA；

(C)离心，用PBS缓冲液洗涤；加入1mL 20mg/mL蜗牛酶溶液，37℃酶解处理，其中，汉逊德巴利酵母的处理时间为30min，莫格球拟酵母的处理时间为45min；

(D)酶解结束后，离心，高渗缓冲溶液洗涤，分别得到汉逊德巴利酵母原生质体和莫格球拟酵母原生质体；悬浮于高渗缓冲溶液中保存。

4.根据权利要求3所述的耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，其特征在于：

所述的高渗缓冲液的组成如下：PBS缓冲液为溶剂，溶质为蔗糖和甘露糖，蔗糖的浓度为170g/L，甘露醇的浓度为0.8mol/L；

所述的PBS缓冲液通过如下步骤制备得到：浓度为0.2mol/L的KH₂PO₄溶液与浓度为0.2mol/L的K₂HPO₄溶液按体积比9:1混匀，HCl调节pH值至5.8。

5.根据权利要求1所述的耐高盐高产酯酵母融合子的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的热处理灭活的条件为于60～65℃水浴保温870～900s，间歇振荡；

步骤(3)中所述的紫外线灭活的条件如下：紫外灯功率30W，照射距离14～15cm时，灭活85～90s。