[发明专利]DNA片断与载体快速连接转化的新方法及其应用

权利要求书

1.一种用于分子生物学中基因克隆的实验方法，该方法包括如下内容：（1）设计接头引物：根据线性载体及待克隆的DNA片断两端序列，设计连接线性载体与DNA片断的接头引物，包含带有载体3'末端序列与DNA 5'末端序列的F adaptor引物，以及带有载体5'末端序列与DNA3'末端序列的R adaptor引物；（2）连接反应：不用DNA连接酶，将线性载体、DNA片断及接头引物按照所需比例混合，通过PCR扩增反应，将DNA片段与线性载体连接起来；PCR产物中含有DNA和载体的连接产物；（3）转化：将上述PCR反应液，直接添加到大肠杆菌感受态细胞中进行热转化；（4）筛选：采用PCR方法或蓝白菌落方法筛选阳性克隆；

其中（1）中连接线性载体与DNA片断的接头引物长度介于20~30个核苷酸，GC含量40%~60%，如果接头引物序列中GC含量超过60%，调整接头引物长度至31~40个核苷酸；

其中（2）中PCR反应体系，线性载体添加量1~100ng，DNA片断添加量1~100ng，接头引物添加终浓度0.2μM~0.4μM；

其中（3）中用于直接转化大肠杆菌感受态细胞的PCR反应液为大肠杆菌感受态细胞总体积的5%~20%。

2.权利要求1中所述的方法，其中（3）中用于直接转化大肠杆菌感受态细胞的PCR反应液为大肠杆菌感受态细胞总体积的10%。

3.权利要求1中所述的方法，其中（4）中筛选阳性克隆的方法，根据所用载体确定；

如果载体带有LacZ基因表达β-半乳糖苷酶活性，利用蓝白菌落筛选阳性克隆；否则，根据载体两端序列设计引物，采用PCR方法检测阳性克隆。