[发明专利]一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法

说明书

本发明公开了一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。本发明的特征在于利用In‑cell Western(ICW)法简便、直观地检测被HTNV感染的细胞。该方法检测灵敏度高(可检测5g的目的蛋白)、周期短(72小时)、结果判读客观、可重复性好、高通量、方法可标准化，便于实验室间推广，特别可针对无细胞病变效应病毒检测其感染力。本发明同时公布了上述方法在HTNV感染力测定(TCID₅₀)、HTNV中和抗体效价测定、抗HTNV分子筛选和鉴定、人HTNV疫苗免疫保护性评价等方面的应用。

技术领域

本发明属于汉滩病毒检测技术领域，涉及一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。

背景技术

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)，是单股负链RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、包膜糖蛋白(GP)和核衣壳蛋白(NP)。该病毒的宿主动物和传染源均为啮齿动物，主要通过动物排泄物污染而经由呼吸道、消化道或破损的皮肤等途径传播给人类，引起一类自然疫源性疾病，即肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renalsyndrome，HFRS)。该病临床表现为发热、出血和急性肾功能损害，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点。

我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，每年发病人数占世界总发病数90％以上，死亡率为0.1-15％。据文献报道，1950-2007年间，我国共发生1,557,622例HFRS，其中死亡46,427例，死亡率约为3％；另据中国疾病预防控制中心统计，2015年我国全年共发生10,812例HFRS，死亡63例。由于HTNV的宿主广泛，传播途径多，且目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。值得注意的是，HTNV还是国际《禁止生物武器公约》所列入的生物战剂，对未来军事活动构成潜在的威胁。

开发、研制HTNV预防性疫苗被认为是预防HTNV感染所致HFRS的最根本手段，而预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体液免疫。高滴度HTNV中和抗体可有效抵抗外来HTNV的感染，因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对于疫苗的研制和质控具有重要意义。

中和试验(neutralization test)是指病毒与相应的抗体结合,抗体中和病毒使其失去了对敏感细胞的感染力，该实验可从待检血清中检出抗体,或从病检样本中检出病毒,从而诊断病毒性传染病，也可测定抗病毒血清中和效价，或者对新分离病毒进行鉴定和分型。其原理是特异性的抗病毒免疫血清(中和抗体)与病毒作用,能够抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳,从而阻止了病毒的繁殖,失去了感染能力。值得注意的是，该反应不仅表现为质的方面,即一种病毒只能被相应的免疫血清中和；而且也表现在量的方面,即中和一定量病毒的感染力,需要一定效价的抗体。

通过中和试验检测病毒中和抗体效价是评价疫苗保护效果的常用方法。常用的中和试验包括简单定性法、固定样本稀释病毒法、固定病毒稀释样本法及空斑减少法。空斑减少法是“金标准”，即用系列稀释的患者血清与等量的已知滴度病毒悬液(100TCID₅₀)混合，在室温下作用一段时间后接种敏感细胞进行培养，以能保护半数细胞培养孔不产生细胞病变(CPE)的血清最高稀释度作为终点效价。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，通过In-cell Western(ICW)技术检测HTNV感染细胞内的病毒核衣壳蛋白，并基于此测定HTNV滴度，具有测灵敏度高、周期短的优势。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，包括以下操作：

1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，培养至80～90％的细胞汇合度；