[发明专利]一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法

权利要求书

1.一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，包括以下操作：

1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，接种细胞数为(2-4)×10⁴/孔，接种孔数＝待测样本数×稀释次数×复孔数，培养至80～90％的细胞汇合度；

2)待步骤1)中细胞汇合度达到70～80％时，采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液的制备：将待测样本等比梯度稀释，每个稀释比例的待测样本分别与等体积的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期间轻柔地颠倒混匀数次；

3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液，每孔加入DPBS洗涤1-2次，然后将步骤(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每个稀释梯度设多个重复样，加样顺序按照从低到高进行；同时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组；

4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液，每孔加入洗涤DPBS1-2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；

5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测；

6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP：首先吸弃微孔板中的培养液，加入PBS洗涤；然后向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定，免摇动在室温条件下孵育；吸弃固定缓冲液，用透膜缓冲液洗脱细胞；吸弃透膜缓冲液，沿管壁向每孔加入封阻液，在摇床上缓慢上摇动室温下孵育；吸弃封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室温下缓慢摇动孵育；吸弃一抗，加入洗涤缓冲液，洗涤多次；吸弃洗涤缓冲液，沿管壁向每孔加入二抗，室温下避光缓慢摇动，孵育；加入洗涤缓冲液，室温下避光缓慢摇动，洗涤多次；洗脱结束之后，完全去除洗脱液；最后，洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光成像系统进行扫描，使用700nm和800nm两个通道同时扫描，以获取HTNV NP的红外荧光强度；

7)计算HTNV中和抗体效价：

获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度，然后计算每孔中HTNV NP红外荧光强度相对比NIR，NIR＝NP荧光值/内参蛋白荧光值；再利用Karber方法计算获得待测样本中和滴度，即中和抗体效价。

2.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，所述用Karber方法计算待测样本中和滴度具体为：

1)计算各病毒稀释度阳性孔数目P和阴性孔数目N，阳性孔的判别标准为，若该孔HTNV感染系数≥1.5，则该孔为阳性，否则为阴性；

其中，NIR本底值为本底组四个孔NIR的算术平均值，微孔板的阳性对照组HTNV感染系数≥1.5是采用该组检测结果，否则重复此板结果；

2)计算中和比值之和，每个稀释梯度的中和比值＝阴性孔/复孔总数，

中和比值之和＝所有稀释梯度的感染比值之和；

3)计算稀释组距，将梯度稀释比例换算成10的指数，以指数等差排列的公差作为稀释组距；

4)计算中和滴度，用Karber法分别测定LgPD50及中和效价，LgPD50＝L+D×(S－0.5)；中和效价＝PD50；其中，L为最低稀释度的对数；D为稀释组距；S为中和比值之和。

3.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，所述的一抗包括抗HTNV NP鼠单抗，以及抗β-actin兔多抗；所述的二抗包括Goat anti-rabbit IRDye^TM 680和Goat anti-mouse IRDye^TM 800CW，分别用以检测700nm和800nm通道的荧光强度。

4.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，在A549细胞感染HTNV后第二天进行ICW检测。

5.如权利要求1所述的高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，所述A549细胞感染HTNV的感染剂量为MOI＝0.1。