[发明专利]一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法

说明书

本发明公开了一种诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素的方法。本发明以西藏绵头雪莲种子为材料，通过组织培养技术诱导愈伤组织，筛选得到花青素高产且遗传稳定细胞系。本发明筛选的绵头雪莲愈伤组织细胞系在常温下生长快，遗传特性稳定，继代培养15‑20天即可获得大量增殖细胞，在改变培养条件的情况下可诱导西藏绵头雪莲愈伤组织产生花青素，实现了常温大量培养与诱导花青素相结合的二段式培养方式，不仅解决了细胞生长与次生代谢产物积累的矛盾问题，也解决了花青素生产的原料问题，可实现雪莲花青素的工业化生产，并且生产成本低，培养周期短，不受自然环境及气候的影响，可以实现周年生产，具有重要理论意义及广阔的市场应用前景。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，涉及植物愈伤组织诱导花青素方法，特别涉及西藏绵头雪莲愈伤组织诱导、继代繁殖、细胞系筛选及花青素的诱导方法。

背景技术

雪莲，属菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea DC.)多年生草本药用观赏植物，主要分布于我国西北高寒山区3600-5750m高山流石滩、高山草甸及悬崖峭壁上，在国外很少有分布。雪莲是西北地区非常重要的藏药植物资源，以花或全草入药。化学成分研究表明，雪莲含有黄酮类、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油，其主要次生代谢产物为黄酮类化合物，这些化合物具有清除自由基、抗衰老、抗辐射、抗癌、抗风湿、镇痛、调节心血管系统、终止妊娠和增强机体免疫力等功能。由于雪莲药用价值高、资源贫乏，已被列为国家三级保护渐危植物。雪莲生长周期一般为5-6年，在7-8月初花时采集药效最好，此时果实正在或刚刚形成，基本没有繁殖能力，而雪莲是靠种子进行繁殖，掠夺性采挖已造成这种珍稀植物濒临灭绝和对生态平衡的严重破坏。因此，利用雪莲种子通过组织培养技术获得愈伤组织细胞是保存种质资源进而解决雪莲资源濒危的有效途径。

青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau，QTP)被称为“世界第三极”，是我国最大、世界上海拔最高的高原，具有寒冷、干燥、缺氧、太阳总辐射高和紫外线强的独特高原气候，高山雪线藏药植物雪莲在如此恶劣环境下生存繁衍至今，必定塑造了其特殊的抗性机制。

花青素又称花青素苷(anthocyanin)，是植物新陈代谢过程中产生的类黄酮类(flavonoid)物质，是决定被子植物花、果实、种皮等颜色的重要色素之一。同时，花青素苷还是一种安全、无毒的天然食用色素，是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂。由世界卫生组织和联合国粮农组织组成的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)考察了花青素的毒理学资料，认为花青素活性功能广泛，副作用小，是一类安全的天然植物色素。目前，花青素已广泛应用于食品、药品、化妆品和保健产品等领域，具有较高研究价值和一定的市场应用潜力。

目前，花青素苷的利用主要局限于资源植物如葡萄、蓝莓、紫薯、紫甘蓝等材料，关于愈伤组织或细胞培养产生花青素的报道还比较少见，而已有研究主要集中在愈伤组织培养中花青素含量的测定以及悬浮细胞培养等方面。存在的主要问题是没有真正建立一个生长状态良好且能长期继代保持的稳定的花青素苷高产细胞系。在环境污染日益严重、人类面临能源危机和资源短缺的情况下，研究与利用植物细胞培养生产次生代谢产物具有重要意义。采用细胞工程进行植物细胞培养具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质成分高、无污染等优点。但细胞增殖生长加快，则次生代谢产物积累量少；而细胞生长较慢，有利于次生代谢产物的积累，因此细胞增殖与次生代谢产物累积的矛盾一直是困扰这一产业的主要问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种雪莲愈伤组织细胞系的制备方法。

本发明的雪莲愈伤组织细胞系的制备方法包括如下步骤：

(1)将雪莲的外植体在愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织；

(2)将所述愈伤组织在愈伤组织继代培养基上进行继代培养，得到雪莲愈伤组织细胞系。

上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织继代培养基中的溶质均包括6-BA和NAA。