[发明专利]一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法

说明书

本发明提供了一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法。将与一段目标DNA序列互补的巯基化的单链DNA固定在金丝热电极表面作为捕获探针，与目标DNA互补以后，形成带有3’平端的双链结构，诱导外切酶III从双链结构的3’平端由3’端向5’端对捕获探针消解，目标DNA被释放，并与其他捕获探针进行新的杂交切酶循环，最终电极表面捕获探针数量明显减少。酶切循环过程前后电极表面捕获探针对检测液中三氯化六氨合钌的电化学吸附信号的减少程度与DNA浓度对数成线性关系，即可实现对目标DNA的检测。本发明提供的检测方法对目标DNA的检测具有检测时间短，灵敏度高，检测线低，选择性好的特点。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法，应用于核酸检测领域。

背景技术

快速、准确、灵敏地对特异DNA序列的检测在基因相关疾病的预防诊断、环境监测、食品监控等领域具有十分重要的意义。通常,实际生化分析样品中仅存在痕量靶物质,因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这一需求,除了直接发展高灵敏的方法外,放大检测法能降低分析方法或传感器的设计难度以及对专业大型仪器的依赖。

根据信号放大手段的不同可分为纳米颗粒信号放大、酶或核酶信号放大及杂交链式反应信号放大等。其中,一种简单、快速的基于外切酶Ⅲ的信号放大方法被广泛运用于DNA 及生物分子的高灵敏检测。作为一种核酸工具酶，外切酶Ⅲ作用于双链核酸分子，并沿3’到5’方向逐步切去单个核苷酸。该酶对单链核酸分子及含有3’突出端的双链核酸分子没有切割活性。另从核酸酶辅助的信号放大策略的通用性来讲,没有序列依赖性的外切酶在探针设计和靶标分析方面更加简便易行,因而显示了更广的应用前景。

外切酶Ⅲ是一种对温度变化十分敏感的生物大分子，温度低于最适温度时酶的活性较差，但过高的温度极易使酶分子结构发生不可逆转的变性导致酶失活。以往报道的电流型生物传感器，大多控制实验体系的整体温度变化，所需装置复杂，操作不易。本发明在热电极表面构建生物传感器，只改变电极表面温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，又增强了溶液对流，提高了传质速率，可缩短传感器到达稳态电流的时间，并增大电极响应信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法。本发明的传感器结构简单、制备工艺简单、检测时间短、灵敏度高、选择性好，为医学诊断等领域中特异性DNA提供了一种快速、低成本的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明利用目标DNA与修饰在金丝热电极上的捕获探针特异性结合，再利用外切酶的切割作用释放目标DNA，实现对目标DNA进行分析检测。电化学DNA生物传感器制备方法具体包括以下步骤：

（1）设计一条捕获探针DNA链CP，所述DNA链CP与目标DNA链TP互补配对，并可以形成带有3’平端的双链结构，诱导外切酶III从双链结构的3’平端由3’端向5’端对捕获探针消解，从而释放目标DNA；CP链的5’端巯基化，使得CP通过金－硫键修饰到金丝热电极表面；其中，捕获探针DNA链CP的DNA序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCA-3’，目标DNA链TP的DNA序列为：5’-TGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’；

（2）将金丝热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金丝热电极；

（3）将含有巯基化捕获探针DNA链CP的缓冲溶液滴加在步骤（2）中处理好的金丝热电极上，再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，得到巯基化捕获探针修饰的金丝热电极；

（4）将步骤（3）中得到的电极浸泡在含有不同浓度目标DNA链TP和外切酶缓冲液中进行杂交酶切循环，反应结束后得到电化学DNA生物传感器。